色谱  2014, Vol. 32 Issue (2): 189-193   PDF (865KB)    
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陈磊
栾军
费晓庆
吴斌
沈崇钰
张睿
高效液相色谱法检测新西兰Manuka蜂蜜中的甲基乙二醛
陈磊 , 栾军, 费晓庆, 吴斌, 沈崇钰, 张睿    
江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心, 江苏 南京 210001
摘要:建立了高效液相色谱法用于检测新西兰Manuka蜂蜜中的甲基乙二醛。将蜂蜜溶于水后加入邻苯二胺水溶液,在室温、避光条件下衍生化反应8 h以上,产物过0.22 μm滤膜后用HPLC检测。以Kromasil反相色谱柱为分析柱;甲醇和0.1%(v/v)乙酸水溶液为流动相,梯度洗脱;检测波长为318 nm;外标法定量。甲基乙二醛在1~50 mg/L范围内线性良好,相关系数为0.9999;检出限(S/N=3)为0.02 mg/L,定量限(S/N=10)为0.06 mg/L;在50、100、200 mg/kg添加水平下的回收率为98.3%~101.5%,相对标准偏差(n=5)小于5%;衍生化产物在24 h内稳定。实验结果表明,该方法前处理过程简单,具有良好的灵敏度、回收率和重复性,可用于新西兰Manuka蜂蜜的质量控制。该方法也适用于中国蜂蜜中甲基乙二醛的检测。
关键词高效液相色谱     甲基乙二醛     Manuka     蜂蜜    
Determination of methylglyoxal in Manuka honey of New Zealand by high performance liquid chromatography
CHEN Lei , LUAN Jun, FEI Xiaoqing, WU Bin, SHEN Chongyu, ZHANG Rui    
Animal, Plant and Food Inspection Center, Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China
Abstract: An HPLC method was developed for the determination of methylglyoxal in Manuka honey of New Zealand. The honey sample was dissolved in water and mixed with o-phenylenediamine solution for derivatization. After the reaction for at least 8 h in the dark at room temperature, the solution was filtered with 0.22 μm membrane and injected into an HPLC system for analysis. The separation was carried out on a Kromasil reversed phase column with gradient elution. The mobile phases were methanol and 0.1% (v/v) acetic acid aqueous solution. The detection wavelength was 318 nm. The external standard method was used for quantitation. The linear range of methylglyoxal was 1-50 mg/L with a correlation coefficient of 0.9999. The LOD (S/N=3) and LOQ (S/N=10) were 0.02 mg/L and 0.06 mg/L, respectively. The recoveries at the spiked levels of 50, 100, 200 mg/kg were 98.3%-101.5% and the RSDs (n=5) were less than 5%. The derivative of methylglyoxal was stable within 24 h. The results showed that the pretreatment of this method is simple and the sensitivity, the recovery and repeatability are good. This method can be used for the quality control of Manuka honey of New Zealand, and also for the detection of methylglyoxal in Chinese honey.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     methylglyoxal (MGO)     Manuka     honey    

Manuka蜂蜜是新西兰特有的一种珍贵蜜种,是蜜蜂采集新西兰特有的一种红茶树——Manuka(Leptospermum scoparium)的花蜜酿造而成的。它区别于其他蜂蜜之处在于Manuka蜂蜜有强大而独特的抗菌活性。蜂蜜一般都具有抗菌活性,这是由蜂蜜本身的高渗透性、较强的酸度并且一般含有过氧化物造成的[ 1, 2 ]。而Manuka蜂蜜的抗菌活性则不依赖于过氧化物,因此被称为非过氧化抗菌活性(non-peroxide antibacterial activity, NPA)。1991年,Molan等[ 3 ]最早报道了这种抗菌活性的物质基础,并将其命名为Manuka独有因子(unique Manuka factor, UMF);由于并不清楚UMF的准确分子结构,采用微生物学方法对Manuka蜂蜜的NPA进行了检测。通过比较Manuka蜂蜜和一系列不同浓度的苯酚溶液对金黄色葡萄球菌的抑制程度,从而对Manuka蜂蜜的NPA进行评级,并标示为UMF5+、UMF10+、UMF15+等等(数字表示苯酚溶液的浓度)。目前,UMF已经被新西兰UMF蜂蜜协会(Unique Manuka Factor Honey Association, UMFHA)作为评价Manuka蜂蜜的质量指标,并要求被授权的蜂蜜生产商将其标注在产品包装上。

2008年,Mavric等[ 4 ]发现甲基乙二醛(methylglyoxal, MGO)可能是Manuka蜂蜜具有NPA的主要物质基础。同年,Adams等[ 5 ]也报道了相同的结论,并且发现Manuka蜂蜜中MGO的含量与NPA的相关性高达0.98。由于采用微生物方法检测NPA操作比较繁琐,结果变异较大,而且物质基础不明确,因此部分研究人员呼吁采用MGO的含量来代替UMF值用于标示Manuka蜂蜜的NPA。但是,也有部分研究人员认为还没有充分的证据证明MGO能完全代表Manuka蜂蜜的NPA,而且UMF更能体现新西兰Manuka植物的地域独特性和绿色环保理念。因此,目前市场上销售的Manuka蜂蜜的产品包装上会有UMF和MGO两种指标来标示Manuka蜂蜜的抗菌活性。

目前国内对Manuka蜂蜜的研究较少,且主要集中在其抗菌活性方面。朱威等[ 1 ]和玄红专等[ 2 ]综述了国外对Manuka蜂蜜抗菌活性的研究。孙艳萍等[ 6 ]研究了Manuka UMF25+、UMF10+以及其他7种蜂蜜对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性,结论为9种蜂蜜在体外均可抑制铜绿假单胞菌,进口蜜更佳。对Manuka蜂蜜中相关物质的检测方法,仅见吕辰等[ 7 ]采用高效液相色谱-串联质谱法对多种蜂蜜中的5种双稠吡咯啶类生物碱进行了筛查,结果发现野百合碱、克氏千里光宁和倒千里光碱均未检出,而千里光菲啉和千里光宁在大多数蜂蜜中均能检出。

MGO属于二羰基化合物,国内报道的检测方法集中在大气环境监测领域。李阳等[ 8 ]建立了一种五氟化苯肼衍生化-热解吸-GC/MS方法对大气中23种羰基化合物进行了测定。牟翠翠等[ 9 ]和冯艳丽等[ 10 ]分别报道了2,4-二硝基苯肼衍生-高效液相色谱法用于测定大气中二羰基化合物。邹婷等[ 11 ]采用五氟苄基羟胺衍生与GC/MS联用的方法分析了大气中的单羰基化合物和多羰基化合物。对于蜂蜜中MGO的检测方法,目前国内尚无相关文献报道。对此,本实验室开发了高效液相色谱法对Manuka蜂蜜的MGO含量进行检测。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪,配有自动脱气机、二元高压泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器及ChemStation数据处理软件(美国Agilent公司); PURELAB Option-Q15纯水仪(英国ELGA公司);电子天平(精确到 0.000 01 g,德国Sartorius公司;精确到0.01 g,瑞士METTLER TOLEDO公司)。

MGO对照品(40%水溶液)购自美国Sigma-Aldrich公司;邻苯二胺(o-phenylenediamine, OPD)购自阿拉丁化学试剂(上海)有限公司;甲醇(色谱纯,德国Merck公司);水为超纯水(18.2 M Ω \5cm); 0.22 μ m有机滤膜(德国Membrana公司)。

Manuka蜂蜜样品由新西兰UMF蜂蜜协会提供,中国蜂蜜样品由通标标准技术服务有限公司提供。

1.2 标准溶液的配制

精密量取MGO对照品100 μ L,用水稀释并定容至10 mL,配成4 g/L 的标准储备液(4 ℃避光保存)。临用前用水将标准储备液逐级稀释为适当浓度的标准工作溶液。

精密称取邻苯二胺0.6 g,用水溶解并定容至100 mL,配成6 g/L的邻苯二胺水溶液。

1.3 样品前处理

称取1 g蜂蜜溶于10 mL水中,取1 mL该蜂蜜水溶液与1 mL邻苯二胺水溶液(6 g/L)混匀,在室温、避光条件下进行衍生化反应8 h以上,过0.22 μ m滤膜后进样分析。

1.4 液相色谱条件

色谱柱:Kromasil反相色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μ m);流动相:0.1%(v/v)乙酸水溶液(A)和甲醇(B);检测波长:318 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μ L;保留时间:10.3 min。梯度洗脱程序:0~5 min, 30%B; 5~10 min, 30%B~90%B; 10~15 min, 90%B; 15~16 min, 90%B~30%B; 16~20 min, 30%B。

2 结果与讨论
2.1 衍生化反应条件的优化

MGO的紫外吸收弱,需衍生化反应后再进行检测。MGO属于1,2-二羰基化合物,Weigel等[ 12 ]报道1,2-二羰基化合物能与邻苯二胺反应生成喹噁啉类化合物(见图1),在反相色谱柱上有较好的保留,且紫外吸收强。Mavric等[ 4 ]和Oelschlaegel等[ 13 ]建立的MGO检测方法中的衍生化条件均是在Weigel等[ 12 ]报道的基础上进行了修改,均为蜂蜜水溶液与邻苯二胺水溶液在室温、避光条件下反应8 h以上,只是蜂蜜样品和邻苯二胺溶液的浓度不同。本实验在室温、避光、反应时间(8 h以上)等衍生化条件不变的基础上,对衍生化试剂的浓度进行了优化。

图 1 (a)邻苯二胺、(b)MGO和(c)MGO衍生化产物的化学结构式 Fig. 1 Chemical structures of (a) OPD, (b) MGO and (c) MGO derivative

将100 mg/L 的MGO标准溶液分别与1、2、4、6、8、10 g/L的邻苯二胺水溶液按体积比1 ∶ 1混合,进行衍生化反应。通过比较MGO衍生化产物的峰面积考察衍生化效率,结果如图2所示。

图 2 邻苯二胺浓度对衍生化效率的影响 Fig. 2 Effect of the mass concentration of OPD on the efficiency of derivatization

从图2中可以看出,邻苯二胺水溶液的浓度从1 g/L升高到6 g/L,衍生化产物的量逐渐上升;从6 g/L升高到10 g/L,衍生化产物的量开始趋于稳定,提示反应到达完全。因此,本实验选择6 g/L的邻苯二胺水溶液。

此外,由于蜂蜜直接稀释后的水溶液含糖量高,对色谱柱伤害较大,本实验对衍生化反应中蜂蜜水溶液的浓度也进行了调整。Mavric等[ 4 ]和Weigel等[ 12 ]报道的方法中蜂蜜水溶液的浓度分别为150和300 g/L,本实验中蜂蜜水溶液的浓度为100 g/L。并且与邻苯二胺溶液等体积混合,因此用于进样的溶液中只含有50 g/L的蜂蜜,能尽量避免高糖基质对色谱柱的损伤。在本实验的方法学验证和实际样品检测完成前后,色谱柱压力和MGO衍生化产物的保留时间均未见明显改变。

2.2 检测波长的选择

文献报道的MGO检测波长为312 nm[ 4, 12 ]或316 nm[ 13 ]。本实验中,通过光谱扫描发现,最佳的检测波长为318 nm。

2.3 线性范围、检出限和定量限

MGO标准溶液与邻苯二胺水溶液进行衍生化反应后进行检测,以衍生化产物的峰面积Y对MGO的质量浓度X(mg/L)进行线性回归,在1~50 mg/L 范围内线性良好,相关系数为 0.999 9。检出限(S/N=3)为0.02 mg/L,定量限(S/N=10)为0.06 mg/L。HPLC图谱见图3,在MGO衍生化产物的保留时间附近并没有干扰峰存在。

图 3 试剂空白(水)及MGO标准溶液(1 mg/L)和Manuka 蜂蜜样品的衍生产物的HPLC图谱 Fig. 3 HPLC chromatograms of reagent blank (water) and the derivatives of MGO standard solution (1 mg/L) and Manuka honey

Mavric等[ 4 ]、Weigel等[ 12 ]和Oelschlaegel等[ 13 ]报道的MGO检出限分别为0.2、0.2、5 mg/kg,本方法的检出限为0.02 mg/L,即0.4 mg/kg;差异的原因可能是所使用的蜂蜜水溶液浓度不同。Mavric等[ 4 ]和Weigel等[ 12 ]报道的检出限较低,但蜂蜜水溶液浓度较高(150和30 g/L),高糖分对色谱柱损伤较大;Oelschlaegel等[ 13 ]使用的蜂蜜水溶液浓度很低(15 g/L),但检出限太高。本实验条件中蜂蜜水溶液浓度介于两者之间,在保证灵敏度的前提下,能尽量减少高糖基质对色谱柱的损伤。而且,Manuka蜂蜜样品中MGO的含量一般较高,本实验的检出限能够满足实际样品的检测需要。

2.4 精密度和回收率

在Manuka蜂蜜样品中分别添加50.0、100.0、200.0 mg/kg 的MGO,每个添加水平重复5次,HPLC检测后计算精密度和回收率。3个添加水平下的RSD分别为1.26% 、0.89%和0.69% ,平均回收率分别为98.3% 、101.5%和99.5%(见表1)。结果表明,蜂蜜中的其他物质对MGO衍生化产物的检测准确度并没有影响。

表 1 Manuka蜂蜜中MGO的精密度和回收率(n=5) Table 1 Precision and recovery of MGO spiked in Manuka honey (n=5)
2.5 衍生化产物的稳定性

在Manuka蜂蜜样品中分别添加50、100、200 mg/kg 的MGO,每个添加水平重复3次,在衍生化反应结束后0 h和24 h分别检测,考察衍生化产物的稳定性。结果如图4所示,衍生化产物在室温放置24 h后仍稳定,蜂蜜中的其他物质对MGO衍生化产物的稳定性没有影响。

图 4 MGO衍生化产物的稳定性(n=3) Fig. 4 Stability of MGO derivative (n=3)
2.6 蜂蜜样品的检测

利用本方法对61个Manuka蜂蜜样品中的MGO含量进行了检测。其中,UMF标示值为5+的蜂蜜样品共14个,MGO含量为(188.0±62.1) mg/kg; UMF标示值为10+的蜂蜜样品共16个,MGO含量为(324.6±90.4) mg/kg; UMF标示值为15+的蜂蜜样品共12个,MGO含量为(523.7±59.1) mg/kg; UMF标示值为20+的蜂蜜样品共13个,MGO含量为(726.1±76.9) mg/kg; UMF标示值为25+的蜂蜜样品共6个,MGO含量为 (1 035.0±75.8) mg/kg。该检测结果与Adams等[ 5 ]和Stephens等[ 14 ]的报道基本相符。

此外,利用本方法对中国不同产地的油菜蜜、荆条蜜、洋槐蜜、椴树蜜、葵花蜜、枣花蜜、荞麦蜜、棉花蜜共16个样品中的MGO含量进行了检测。结果显示,MGO含量均≤1 mg/kg。Stephens等[ 14 ]报道,新西兰Kanuka蜜、三叶草蜜、Rewarewa蜜和甘露蜜中MGO的含量均远低于Manuka蜜。Arena等[ 15 ]报道,意大利刺槐蜜、栗子蜜、柑橘蜜、桉树蜜、甘露蜜以及多花种混合蜂蜜中MGO的含量均≤3 mg/kg。以上研究结果均显示,MGO为Manuka蜂蜜中的特有成分。本文建立的MGO含量检测方法,可以为我国进口Manuka蜂蜜的质量评价提供参考。

3 结论

建立了高效液相色谱法用于检测新西兰Manuka蜂蜜中的甲基乙二醛。该方法前处理简单,具有良好的灵敏度、回收率和重复性,可用于新西兰进口蜂蜜的质量控制,也适用于中国蜂蜜中甲基乙二醛的检测。

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