色谱  2019, Vol. 37 Issue (2): 155-161   PDF    
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卫辰
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李月琪
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冀峰
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黄涛宏
液相色谱-串联质谱法测定百日咳和百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素
龙珍1#, 卫辰2#, 郭志谋3, 马霄2, 李月琪1, 姚劲挺1, 冀峰1, 李长坤1, 黄涛宏1     
1. 岛津企业管理(中国)有限公司, 北京 100020;
2. 中国食品药品检定研究院, 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室, 北京 102629;
3. 中国科学院分离分析化学重点实验室, 中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁 大连 116023
摘要:百日咳杆菌气管细胞毒素(TCT)是一种引起百日咳及百日咳相关疫苗不良反应的毒性糖肽。尽管各国药典均规定了百日咳疫苗产品中TCT的含量限度,但均没有推荐TCT的含量测定方法。该研究发展了一种液相色谱-串联质谱法用于TCT的含量测定。实验优化了包括色谱柱类型和流动相组成在内的TCT色谱条件。虽然TCT在反相色谱模式和亲水作用色谱(HILIC)模式下均具有较好的保留,但HILIC模式与蛋白质沉淀的前处理方法兼容性更好,因此采用HILIC模式分离TCT。优化所得的方法具有较宽的线性范围(5.76~369 ng/L),良好的重复性(峰面积的相对标准偏差不大于3.9%),各种基质中均有较好的回收率(96.4%~102.5%),且定量限是药典要求的TCT最高限量的1/1279。将本方法用于共纯化百日咳疫苗、组分百日咳疫苗、共纯化无细胞百白破疫苗和组分无细胞百白破疫苗中TCT的检测,所有产品均未检出TCT,表明被检样品具有较好的工艺条件可避免TCT在产品中的残留。
关键词液相色谱    质谱    百日咳杆菌气管细胞毒素    百白破疫苗    百日咳疫苗    
Determination of tracheal cytotoxin in pertussis and diphtheria tetanus acellular pertussis vaccines using liquid chromatography-tandem mass spectrometry
LONG Zhen1#, WEI Chen2#, GUO Zhimou3, MA Xiao2, LI Yueqi1, YAO Jinting1, JI Feng1, LI Changkun1, HUANG Taohong1     
1. Shimadzu Scientific Instrument Company, Beijing 100020, China;
2. National Institutes for Food and Drug Control, Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, Beijing 102629, China;
3. Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China
Abstract: Tracheal cytotoxin (TCT) is a toxic glycopeptide, which contribute to the adverse effects of pertussis toxin (PT) and related vaccines. Although pharmacopeias limit the amount of TCT in PT product, there is no recommended TCT determination method in any pharmacopeia. In this study, a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was developed to determine TCT. Chromatographic conditions, including column-type and mobile-phase composition, were optimized. According to the literature reports, both reversed-phase liquid chromatography (RPLC) and hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) can provide a good retention for TCT. A large amount of organic solvent is usually used for protein precipitation, which may affect the RPLC mode, leading to peak distortion, while such effects were not observed in HILIC mode. Thus, HILIC mode was used to analyze TCT in this study. The developed method had a wide linear range (5.76-369 ng/L), good precision (no more than 3.9%), satisfied recoveries in various matrices (96.4%-102.5%). The limit of quantification (LOQ) of the developed method was 1279 times lower than the one required by Chinese Pharmacopeia, wherein the required amount of TCT should be less than 2 pmol per dose. The developed method was used to detect TCT in pertussis vaccine (acellular component), pertussis vaccine (acellular, co-purified), co-purified diphtheria tetanus pertussis vaccine, and component diphtheria tetanus acellular pertussis vaccine. As a result, TCT was not detected in any of the selected samples indicating the safety of these vaccines and PT products.
Key words: liquid chromatography (LC)     mass spectrometry (MS)     tracheal cytotoxin (TCT)     diphtheria tetanus pertussis acellular vaccine (DTaP)     pertussis vaccine (PT)    

百白破(DTP)疫苗由百日咳疫苗、白喉疫苗和破伤风疫苗联合组成, 是全球范围内应用最广的疫苗之一, 同时也是报道不良反应次数最多的疫苗。2015年, 百白破疫苗不良反应约占中国疫苗不良反应的三分之一[1]。百日咳杆菌气管细胞毒素(TCT)最早由Goldman等[2]从百日咳杆菌培养液中发现, 它的存在被认为是导致百日咳和百白破疫苗不良反应的原因之一。在呼吸道上皮细胞培养实验中发现, 浓度为1 μ mol/L的TCT即可摧毁纤毛细胞群[2]。当纤毛细胞被破坏以后可以产生类似百日咳的症状, 如咳嗽甚至肺部感染[3]。由于TCT的高活性和破坏力, 各国药典均对百日咳疫苗中TCT的最高含量做出了限定, 即不得超过2 pmol/剂。按照通常百白破疫苗的体积(0.5 mL)计算, TCT在成品中不得超过4 nmol/L。

尽管各国药典均对TCT的含量做出了限定, 但由于无商品化TCT对照品、TCT对照品制备困难和缺乏高灵敏度、高选择性的TCT检测方法等原因, 目前各国药典均无TCT的检测方法记载。TCT无强紫外吸收基团且易受疫苗基质干扰, 即使采用低波长检测, 仍然无法实现复杂疫苗基质中TCT的高灵敏度准确检测。例如, 以204 nm为检测波长, 进样10 μL浓度为4 nmol/L的TCT对照品, 无明显紫外吸收峰检出。Goldman等[4]将柱前衍生-HPLC-UV方法用于疫苗中TCT的含量测定, 该方法在进样200 μL时, 可实现浓度为5 nmol/L TCT的检测, 该方法灵敏度与药典要求尚存在一定差距, 且方法耗时较长(45 min)。此外, 衍生效率受基质和衍生试剂干扰, 从而影响定量的准确性、重复性和再现性[3], 不能实现疫苗中TCT的高灵敏度、高选择性、高准确度检测, 且定量所需消耗的对照品质量较多, 增加了TCT对照品制备的工作量。通用型检测器为紫外检测器的有利补充, 无需衍生即可实现弱紫外吸收和无紫外吸收化合物的检测[5-8]。但通用型检测器的灵敏度通常在mg/L级别, 无法满足各国药典对TCT含量检测的限量要求。更重要的是, 无论是紫外检测器还是通用型检测器均需要对照品, 通过对比样品和对照品保留时间定性。目前尚无商品化的TCT对照品, 且TCT对照品的制备复杂。通过48 h培养、纯化1 L TCT培养液最多只能制备得到700 nmol的TCT对照品[2]

为了实现疫苗中TCT的有效定性和定量分析, 需要发展一种无须衍生、灵敏度好、选择性较高、适合百日咳和百白破疫苗中TCT的快速检测的方法。本文发展了一种亲水作用色谱(HILIC)-MS/MS方法用于百日咳和百白破疫苗中TCT的定性和定量分析。从百日咳杆菌培养液中纯化得到TCT样品后, 通过LC-离子阱飞行时间质谱表征确定其结构后作为对照品, 用于HILIC-MS/MS定量方法的发展。系统优化了TCT检测的色谱条件和MRM参数, 并对方法的重复性、回收率、线性关系、检出限(LOD)和定量限(LOQ)等进行了考察。方法优化后, 将其用于两种主流工艺(共纯化和组分)所得百日咳和百白破疫苗中TCT的检测。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

LC-MS/MS系统包括LCMS-8045三重四极杆质谱、LC-20ADXR高压二元泵、脱气机、SIL-30AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱、SPD-M30A紫外检测器, 用于TCT的定量。LCMS-IT-TOF系统用于TCT的结构确定。LCMS-8045和LCMS-IT-TOF均使用ESI离子源并同时监测正、负离子模式。LabSolutions和LCMSSolution工作站分别用于LCMS-8045和LCMS-IT-TOF的数据处理。以上仪器和软件购自岛津(京都, 日本)。

乙腈、甲酸和低吸附离心管购自Merck (MA, USA)。超纯水由Milli-Q系统制备(Millipore, USA)。HILIC色谱柱Click XAmide (150 mm×2.1 mm, 3 μ m)由中国科学院大连化学物理研究所提供。QMA柱为购自Waters的阴离子交换固相萃取柱。共纯化百日咳疫苗(厂家1和2)、组分百日咳疫苗(厂家3和4)、组分百白破疫苗(厂家5和6), 共纯化百白破疫苗(厂家7、8和9)和疫苗基质(百日咳和百白破疫苗基质)由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 溶液配制、TCT对照品的制备

QMA柱所用平衡液和洗涤液均为含有10 mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液(pH 5.5), 其中甲醇与水的体积比为2: 8。QMA柱洗脱液为含有10 mmol/L乙酸铵、1 mol/L氯化钠的甲醇水溶液(pH 5.5), 其中甲醇与水的体积比为2: 8。TCT对照品参考文献[2]的方法制备, 具体步骤如下。(1)纯化:百日咳杆菌培养液在4 ℃下采用高速离心的方法去除大分子杂质, 取上清液过0.22 μ m醋酸纤维素膜进一步去除溶液中的大分子杂质, 收集滤液, 用三氟乙酸调节滤过液pH值至3。(2)C18柱纯化TCT:用甲醇和体积分数为0.1%的三氟乙酸水溶液依次洗涤C18填料; 将洗涤后的C18填料填装在玻璃柱中, 然后注入纯化步骤所得滤液; 抽干柱中溶液, 再用体积分数为0.1%的三氟乙酸水溶液洗涤色谱柱; 用三氟乙酸-正丁醇-水(1: 200: 800, v/v/v)溶液洗脱TCT并收集馏分; 减压浓缩馏分以备QMA柱纯化。(3)深度纯化:用平衡液浸润QMA柱10 min, 再用20 mL洗涤液清洗QMA柱, 再用20 mL甲醇清洗QMA柱, 最后用20 mL平衡液平衡QMA柱。将减压浓缩所得馏分注入QMA柱, 再用洗涤液洗涤未结合蛋白质, 然后用洗脱液洗脱TCT并收集。(4)脱盐:用三氟乙酸酸化第(3)步所得TCT溶液至pH为3, 再按富集步骤的操作流程上样并收集TCT脱盐馏分, 冻干TCT脱盐馏分, 得TCT对照品, 称重后放置于-80 ℃保存。

1.3 疫苗样品的前处理

向疫苗样品中加入乙腈, 直到乙腈体积分数为80%, 充分振荡、混合样品1 min后, 置于离心机中以14 000 r/min离心15 min。取上清液用于LC-MS/MS分析。处理前和处理后疫苗样品均放置于4 ℃保存。

1.4 HPLC条件

LCMS-IT-TOF定性分析TCT与LCMS-8045定量分析TCT的HPLC条件相同。进样体积为10 μL; 色谱柱:Click XAmide (150 mm×2.1 mm, 3 μ m); 流动相A为10 mmol/L甲酸铵水溶液(pH 3.0), 流动相B为10 mmol/L甲酸铵乙腈溶液(每升含100 μL甲酸)。流速为0.3 mL/min; 梯度:0~5 min, 75%B~20%B; 5~5.1 min, 20%B~75%B; 5.1~9 min, 75%B。0~2 min的色谱柱洗脱液由六通阀切换至废液, 其余切换到MS检测。

1.5 MS条件

TCT定性:离子源为电喷雾电离源, 正离子模式; 离子化电压为3.5 kV; 雾化气流速为1.5 L/min; 加热模块温度为200 ℃; 脱溶剂管(CDL)温度为235 ℃; 检测器电压为1.70 kV; TOF飞行管温度为(40.0±0.3) ℃; 质谱数据采集范围m/z 300~1 500;三氟乙酸钠(NaTFA)溶液用于正负离子模式校正。

TCT定量:离子源为电喷雾电离源, 正离子模式; 扫描模式为多反应监测(MRM)模式; 离子化电压为3.0 kV; 离子源温度为300 ℃; 脱溶剂管(DL)温度为235 ℃; 雾化气流速为3 L/min; 干燥气流速为10 L/min; 加热器流速为10 L/min。TCT的3个离子对通道用于TCT分析(见表 1)。

表 1 MRM模式下TCT的MS/MS参数 Table 1 MS/MS parameters used for tracheal cytotoxin (TCT) in MRM mode
1.6 标准溶液

将对照品制备步骤中所得TCT对照品(0.1 mg)用1 mL水溶解, 配制成质量浓度为100 μ g/L的TCT母液。取TCT母液, 用疫苗基质逐级稀释成质量浓度为369、184.5、92.25、46.13、23.06、11.53、5.76 ng/L, 进样10 μL, 获取线性曲线。

LOD和LOQ测试溶液配制方法如下:取质量浓度为5.76 ng/L的TCT溶液, 用疫苗基质稀释成质量浓度为2.88 ng/L和0.74 ng/L。

2 结果与讨论
2.1 TCT对照品的结构鉴定

由于尚无商品化的TCT对照品, 在发展TCT定量方法前需制备TCT对照品。根据文献[2]方法制备、纯化得到TCT样品后用LCMS-IT-TOF鉴定其结构。根据LCMS-IT-TOF的一级质谱数据(图 1a)结合formula predictor软件测得TCT分子式为C37H59N7O20, 该结构与文献[2]报道一致。由于所得TCT对照品质量较少(0.1 mg)且TCT固体对照品容易吸水(核磁氢谱中受水峰影响较大), 难以实现用核磁共振测试其纯度, 本文采用质谱和紫外光谱法辅助测试样品纯度。在m/z 100~2 000范围内和在200~400 nm范围内分别获取TCT总离子流图(图 1c)和紫外光谱图(图 1d), 其中210 nm处的色谱图见图 1d。从图 1c可以看到, 除TCT主峰以外, 无其他杂质峰检出。如图 1d所示, TCT样品中无杂质峰检出。由于TCT紫外吸收弱, 低浓度TCT也无法被紫外检测器检出。

图 1 LCMS-IT-TOF所得TCT的(a)一级质谱图、(b)二级质谱图、(c)总离子流图以及(d)TCT对照品的紫外光谱图 Fig. 1 (a) MS spectrum, (b) MS2 spectrum, (c) total ion chromatogram of TCT obtained by LCMS-IT-TOF and (d) UV/Vis chromatogram of TCT Injecting 10 μL 1 mg/L TCT to obtain total ion chromatogram of TCT in the range of m/z 100-2000. Injecting 10 μL 0.1 mg/mL TCT to obtain 3D UV/Vis spectrum of TCT in the wavelength range of 190-400 nm.
2.2 色谱条件优化
2.2.1 色谱模式的选择

由于大分子化合物(如疫苗中的铝佐剂、蛋白质等)容易堵塞分离系统, 污染色谱柱, 导致系统压力升高、保留时间漂移和色谱峰变形, 因此需要采用适当的前处理步骤将其去除。蛋白质沉淀技术(PPT)[9]是常用的蛋白质沉淀和铝佐剂去除方法。PPT处理后的样品通常溶解在高浓度有机溶剂中。在反相分离(RPLC)模式中, 高浓度有机溶剂为强洗脱溶剂, 以高浓度有机溶剂为样品溶剂容易造成RPLC分离色谱峰分叉、变形甚至穿透等溶剂效应现象[10-12]。在HILIC模式中高浓度有机溶剂为弱洗脱溶剂[13], 不但没有RPLC分离出现的溶剂效应, 当HILIC分离初始流动相中有机相比例低于样品溶剂中有机溶剂比例时, 还具有柱头富集的作用。虽然TCT在RPLC和HILIC模式中均可保留, 但HILIC模式具有与PPT处理溶剂兼容性的优点。因此, 选择HILIC模式用于疫苗中TCT的分离。

2.2.2 流动相组成的优化

本文考察了流动相pH值(3.0~6.3)、缓冲盐浓度(5~20 mmol/L)和初始乙腈体积分数(85%~60%)对TCT保留行为的影响, 如图 2所示。随着流动相中pH的增加, TCT保留增强且呈现拖尾峰(图 2a), pH过低不利于色谱柱的长期稳定性, 综合考虑选择pH 3.5用于TCT分离。pH 3~4是甲酸铵的常用缓冲范围, 故选择甲酸铵作为缓冲盐。流动相中缓冲盐浓度的增加可增加亲水层的极性, 增强化合物的亲水保留, 但同时降低离子交换保留和增加MS检测背景噪音。本文选择10 mmol/L甲酸铵作为TCT分离的缓冲盐浓度, 该浓度相对于5 mmol/L甲酸铵(图 2b)作流动相添加剂无明显MS背景增加[12], 且TCT峰形更为对称、柱效更高(图 2c), 有利于提高检测灵敏度。随着初始流动相中乙腈含量的减少, TCT保留变弱, 因此确定初始流动相中乙腈的体积分数为75%, 并在5 min内线性降低到20%。该起始体积分数(75%)低于PPT处理所得样品中乙腈的体积分数(80%), 可避免溶剂强度带来的溶剂效应[14]。如图 2c所示, TCT在乙腈体积分数约为36%时从色谱柱洗脱, 该体积分数高于C18分离TCT时所用乙腈含量(20%)。当乙腈体积分数低于80%时, 随着乙腈体积分数的增加, 可有效增加雾化效率[15], 从而提高检测灵敏度。

图 2 不同流动相组成下TCT的MRM图 Fig. 2 MRM chromatograms of TCT obtained with different mobile phases Ammonia format buffer: a. 5 mmol/L ammonia format (pH 5.0); b. 5 mmol/L ammonia format (pH 3.5); c. 10 mmol/L ammonia format (pH 3.5).
Mobile phase A: ammonia format buffer; mobile phase B: ammonia format buffer in acetonitrile. Flow rate: 0.3 mL/min. Gradient: 0-5 min, 75%B-20%B; 5.0-5.1 min, 20%B-75%B; 5.1-9.0 min, 75%B.
2.3 TCT定量分析时质谱条件的优化

首先在m/z 100~2 000范围内, 采用ESI+扫描方式获取TCT对照品的一级质谱图(见图 3a)。从一级谱图中得到TCT的[M+H]+m/z 922.4。在10~50 eV碰撞能范围内获取TCT的产物离子谱图, 选择多种碰撞能下均可获得且响应最高的3种产物离子作为TCT的MRM监测通道, 在这3个通道中, 选择信噪比最高的离子对m/z 922.4→719.3作为定量离子对, 其他两个通道m/z 922.4→391.1和922.4→302.1作为参比离子通道用于TCT定性筛查, MRM谱图见图 3。在确定监测离子对后, 采用自动优化模式对各离子对的碰撞能、Q1电压和Q3电压进行优化, 优化结果见表 1

图 3 LC-MS/MS分析所得(a)TCT对照品的一级质谱图与(b)TCT对照品、(c)疫苗空白基质和(d)空白溶剂的MRM谱图 Fig. 3 (a) MS spectrum and MRM chromatograms of (b) TCT control, (c) vaccine matrix, and (d) sample solvent by LC-MS/MS
2.4 方法学考察

本文从选择性、样品残留、LOD、LOQ、重复性、定量准确度和线性范围对发展的LC-MS/MS方法进行了考察。

2.4.1 选择性

将LC-MS/MS方法用于疫苗基质的分析, 在TCT出峰处无明显信号峰(见图 3c), 表明该方法不受样品处理溶剂和疫苗基质的干扰, 可在复杂的疫苗基质中选择性检测TCT, 是一种高选择性的分离检测方法。

2.4.2 样品残留

用LC-MS/MS方法分析高浓度TCT对照品(369 ng/L), 随后进空白溶剂分析, 在TCT出峰处无明显MRM信号峰检出, 表明该方法无明显残留(见图 3d)。空白溶剂为乙腈:水(8: 2, v/v)。因此, 该方法可用于较宽浓度范围内样品的分离检测, 高浓度样品分析后无需增加色谱柱和系统的清洗步骤, 即可实现低浓度样品的分离检测。

2.4.3 LOD和LOQ

将常见的两种获取多肽LOD的方法(理论计算和实验验证)用于TCT的LOD测定。

理论计算:采用Keshishian等[16]报道的统计学公式LOD=Mb+t0.95 (SDb+SDs)/$\sqrt n $进行计算。其中, Mb和SDb分别为空白样品的平均偏差和标准偏差, SDs为线性曲线最低浓度点样品的标准偏差, t0.95是样本量n=4时的t分布值。LOQ=3×LOD。经测试和计算得到本方法的LOD和LOQ分别为0.72 ng/L和2.88 ng/L。

实验验证:配制理论计算所得LOD和LOQ对应浓度的TCT对照品溶液进样测试, 结果显示质量浓度为0.72 ng/L和2.88 ng/L的TCT的信噪比(S/N)分别为3.2和13.4。

结合柱上样量, 对比本方法和文献中灵敏度最高的柱前衍生-HPLC-UV方法[2](进样200 μL, LOQ为1 408.5 ng/L), 本方法的灵敏度比文献方法[2]高9 781倍。药典规定疫苗中TCT含量不得超过2 pmol每剂。按照通常疫苗体积0.5 mL计算, 药典控制浓度应为3 684 ng/L。本方法的LOQ (2.88 ng/L)是药典要求疫苗中TCT最高残留量的1/1 279。此外, 该方法仅需9 min(含色谱柱平衡)即可完成一个样品中TCT的检测, 与柱前衍生-HPLC-UV方法(45 min)[2]相比, 具有更高的检测通量。

2.4.4 线性曲线

配制质量浓度从5.76 ng/L到369 ng/L范围内的TCT对照品溶液, 共7个浓度样品, 每个浓度样品进样3次。将每个浓度所得TCT的峰面积(y)与对应质量浓度(x, ng/L)作线性曲线, 得工作曲线:y=1 164.7x-1 201.7, R2=0.999 5。线性曲线的定量准确性用回收率A表示。A=C测试浓度/C标准浓度×100%。C测试浓度为实际测得的TCT质量浓度, 计算方法为将线性曲线浓度点峰面积带入工作曲线, 计算所得浓度。C标准浓度为配制的对照品溶液的实际浓度。经计算所得, 线性曲线的7个浓度点回收率在98.7%到104.8%范围内, 表明该方法用于5.76 ng/L到369 ng/L浓度范围内TCT的含量测定具有较高的准确性。

2.4.5 重复性

考察了低质量浓度(11.53 ng/L)和中等质量浓度(92.25 ng/L)的TCT对照品溶液进样5次的峰面积重复性, 其RSD分别为3.9%和2.7%。TCT为疫苗中需严格控制的有毒物质, 如果疫苗中存在TCT, 为保证定量准确性, 避免疫苗质量的误判, 测定其含量所用标准曲线建议每天测试。

2.5 百日咳和百白破疫苗中TCT的含量测定

将优化后的LC-MS/MS方法用于9个不同厂商生产的共纯化百日咳疫苗、组分百日咳疫苗、共纯化百白破疫苗和组分百白破疫苗中TCT的筛查和含量测定。如表 2所示, 9个疫苗样品中均无TCT检出, 表明这些疫苗均未受TCT污染。方法回收率由以下方法[3, 17]测试:回收率=(A加标-A样品)/A×100%, 其中A加标为疫苗加标样品进样所得TCT峰面积, A样品为样品进样所得TCT峰面积; A为对照品溶液进样所得TCT峰面积。回收率测试溶液配制方法如下:(1)标样配制:取质量浓度为184.5 ng/L的TCT溶液100 μL, 加入900 μL疫苗空白基质。(2)样品配制:取疫苗样品900 μL, 加入100 μL疫苗空白基质。(3)样品加标:取疫苗样品900 μL, 加入100 μL质量浓度为184.5 ng/L TCT溶液。如表 2所示, TCT在所有样品基质中均具有较好的回收率, 表明共纯化百日咳疫苗、组分百日咳疫苗、共纯化百白破疫苗和组分百白破疫苗基质均对TCT检测没有明显抑制作用[18]

表 2 百日咳和百白破疫苗样品中TCT的检测结果和回收率 Table 2 Detection results and recoveries of TCT in pertussis vaccine (PT) and diphtheria tetanus acellular pertussis vaccine (DTaP) samples
3 结论

本文发展了一种HILIC-MS/MS方法用于共纯化百日咳疫苗、组分百日咳疫苗、共纯化百白破疫苗和组分百白破疫苗中TCT的检测。该方法可实现不同厂家百日咳和百白破疫苗中TCT的高灵敏度快速筛查, 其灵敏度比已报道的衍生-HPLC-UV方法高9 781倍, LOQ是药典要求疫苗中TCT最高残留量的1/1 279, 完全满足药典对百日咳和百白破疫苗中TCT含量测定的要求。

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