色谱  2019, Vol. 37 Issue (2): 177-182   PDF    
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励炯
孙岚
金朦娜
王红青
邱红钰
分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中7种非选择性环氧化酶抑制药物
励炯, 孙岚, 金朦娜, 王红青, 邱红钰     
杭州市食品药品检验研究院, 浙江 杭州 310017
摘要:建立并优化了使用分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱(dSPE-UPLC-MS/MS)检测奶粉中7种非选择性环氧化酶(COX)抑制药物残留的方法。样品用0.01 mol/L pH 2.5抗坏血酸溶液-乙腈-乙酸乙酯(2:5:5,v/v/v)溶液提取后,加入无水硫酸钠、十八烷基键合硅胶吸附剂(C18-N)及NH2-丙基乙二胺吸附剂(NH2-PSA)组成的盐包进行净化。以Waters CORTECS UPLC C18(100 mm×2.1 mm,1.6 μm)色谱柱分离,流动相为0.1%(体积分数)甲酸水溶液和0.1%(体积分数)甲酸乙腈,配合多反应监测(MRM)模式定性定量分析水杨酸、布洛芬、双氯芬酸钠、吲哚美辛、吡罗昔康、萘普生和保泰松7种成分。结果表明:7种化合物线性相关性良好,相关系数(r2)≥ 0.9957。高、中、低3个水平下,加标回收率为76.4%~89.8%。定量限为2~5 μg/kg。该方法前处理简单,回收率高,重现性好,可作为奶粉中7种非选择性COX抑制药物残留的有效检测方法。
关键词超高效液相色谱-串联质谱    分散固相萃取    非选择性环氧化酶抑制药物    奶粉    
Determination of seven non-selective cyclooxygenase inhibitors in milk powder by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with dispersive solid phase extraction
LI Jiong, SUN Lan, JIN Mengna, WANG Hongqing, QIU Hongyu     
Hangzhou Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310017, China
Foundation item: Science and Technology Plan of Zhejiang Food and Drug Administration (No. 2018004); Agricultural and Social Development Research Project of Hangzhou (No. 20180533B19)
Abstract: An ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with dispersive solid phase extraction (dSPE-UPLC-MS/MS) method was developed to determine seven non-selective cyclooxygenase inhibitors in milk powder. The samples were extracted with 0.01 mol/L pH 2.5 ascorbic acid-acetonitrile-ethyl acetate solution (2:5:5, v/v/v), and then purified with a mixture of anhydrous sodium sulfate, octadecyl carbon silica gel (C18-N) sorbent and ethylenediamine-N-propyl carbon silica gel (NH2-PSA) sorbent. The analysis was performed using a UPLC-MS/MS system with Waters CORTECS UPLC C18 (100 mm×2.1 mm, 1.6 μm) column. The mobile phase consisted of 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid by gradient elution, and the multiple reaction monitoring (MRM) mode was used. Five linear calibration curves were obtained with correlation coefficients (r2) ≥ 0.9965. The recoveries were determined at three spiked levels and ranged from 76.4% to 89.8%. The limits of quantification (LOQs) were from 2 to 5 μg/kg. This method is suitable for the determination of seven non-selective cyclooxygenase inhibitors in milk powder.
Key words: ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     dispersive solid phase extraction (dSPE)     non-selective cyclooxygenase inhibitor     milk powder    

非甾体类抗炎药物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)是一大类具有抗炎、止痛和解热等疗效的药物总称, 其中有一类属于非选择性环氧化酶(cyclooxygenase, COX)抑制药物, 其作用机理是通过抑制COX的活性来抑制前列腺素的分泌, 从而缓解肌肉和关节的局部疼痛、肿胀等症状[1, 2]。非选择性COX抑制药物已被广泛用于人和牲畜的疾病预防与治疗[3], 但对人体和牲畜也有诸多毒副作用, 能引起肠胃道功能紊乱、过敏、再生障碍性贫血、凝血功能障碍、肝肾毒性、心血管疾病以及中枢神经系统损害等[4-6]。有研究[7]表明, 长期使用非选择性COX抑制药物会引起大鼠的肾脏癌变和小鼠的肝脏癌变。欧盟、美国和日本[8]已针对部分非选择性COX抑制药物在动物源性食品中的最大残留限量做了规定。

非选择性COX抑制药物是由不同化学结构组成的一类化合物, 很多化合物化学性质完全不同, 这就带来一个同时检测多种非选择性COX抑制药物的方法开发的难题, 特别是样品前处理(包括提取和净化)[9]。目前, 已报道的非选择性COX抑制药物的检测方法主要有高效液相色谱法[10, 11]、液相色谱-质谱联用法[12-15]、气相色谱-质谱联用法[16, 17]、毛细管电泳法[18]、生物传感器法[19]等。液相色谱-质谱联用法由于具有较高的灵敏度和选择性, 非常适合多种药物残留的检测, 已经被广泛应用于非选择性COX抑制药物的检测[20, 21], 比如Gallo等[22]报道了利用串联质谱法同时检测人体血清中16种非选择性COX抑制剂的方法; Dubreil-Chéneau等[13]和Gentili等[18]利用串联质谱法分别开发了牛乳中12种和15种非选择性COX抑制药物残留的检测方法; Dowling等[23]利用高分辨质谱法检测牛乳中8种非选择性COX抑制药物残留。上述方法的前处理多用甲醇或乙腈进行提取, 再经液液萃取净化或SPE固相萃取小柱净化处理, 缺点是在大批量检测中耗时较长。本文采用分散固相萃取(dSPE)对奶粉中非选择性COX抑制药物进行净化, 并利用灵敏度高和抗干扰性强的超高效液相色谱-串联质谱法, 对奶粉中7种非选择性COX抑制药物进行定性定量分析。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪(包括Agilent 1290高效液相色谱仪和Agilent 6425串联四极杆质谱仪, 美国Agilent公司)、Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司)、Sorvall ST 8R高速冷冻离心机(德国Thermo Fisher公司)、MS3旋涡混合器(德国IKA公司)。

标准品:水杨酸(批号100106-201605, 质量分数99.7%)、布洛芬(批号100179-201406, 质量分数99.5%)、双氯芬酸钠(批号100334-200302, 质量分数100%)、吲哚美辛(批号100528-200904, 质量分数99.9%)、吡罗昔康(批号100177-200603, 质量分数99.8%)、萘普生(批号100198-201205, 质量分数99.6%)、保泰松(批号100481- 200601, 质量分数99.9%)购自中国食品药品检定研究院; 盐酸、抗坏血酸、氯化钠、无水硫酸镁(均为分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司; 乙腈、甲酸、乙酸乙酯(均为色谱纯)购自德国Merck公司; 十八烷基键合硅胶吸附剂(C18-N)和NH2-丙基乙二胺吸附剂(NH2-PSA)购自上海岛津技迩公司。

1.2 标准溶液的配制

分别取7种非选择性COX抑制药物的标准品10 mg, 用乙腈配制成1 000 mg/L的标准储备溶液, 于-20 ℃冰箱中保存, 备用。

分别吸取适当体积的标准品储备溶液, 用乙腈稀释成10 mg/L的混合标准中间溶液, 于-4 ℃冰箱中保存, 备用。

用乙腈稀释混合标准中间溶液, 配制成水杨酸、吲哚美辛、吡罗昔康和保泰松的线性范围为5~200 μg/L, 萘普生、双氯芬酸钠和布洛芬的线性范围为10~200 μg/L的溶剂混合标准工作溶液, 现用现配。

1.3 质控样品的配制

取2.0 g空白奶粉(检测结果为阴性的奶粉), 置于50 mL聚氟乙烯离心管中, 加入一定量的混合标准中间溶液, 使7种非选择性COX抑制药物在样品中的质量浓度为50 μg/kg, 即为质控样品。

1.4 样品前处理

提取:取2.0 g奶粉, 置于50 mL聚氟乙烯离心管中, 加入5 mL去离子水, 涡旋振荡2 min, 使样品充分溶解, 加入2 mL 0.01 mol/L的抗坏血酸溶液(用1 mol/L盐酸溶液调pH至2.5), 涡旋振荡30 s, 依次加入10 mL乙腈-乙酸乙酯(1: 1, v/v)溶液、1 g醋酸铵和5 g无水硫酸镁, 涡旋振荡1 min, 超声提取5 min, 在4 ℃以5 000 r/min的速度离心5 min。取7 mL上清液移入新的50 mL聚氟乙烯离心管中, 待净化。

净化:在待净化的样品溶液中加入净化剂(含1 000 mg无水硫酸钠、300 mg C18-N及100 mg NH2-PSA), 旋涡混匀1 min, 以5 000 r/min的速度离心5 min。精密取5 mL上清液转移至试管中, 于40 ℃水浴下氮吹至近干。加入0.5 mL 0.1%(体积分数, 下同)甲酸水溶液-乙腈(1: 1, v/v), 旋涡混匀1 min, 溶解残渣, 用0.22 μm有机滤膜过滤, 取滤液进行分析。

1.5 色谱和质谱条件

色谱柱:Waters CORTECS C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 流动相:A相为0.1%甲酸水溶液, B相为0.1%甲酸乙腈。梯度洗脱程序:0~8.0 min, 90%A~45%A; 8.0~9.0 min, 45%A; 9.0~9.1 min, 45%A~90%A; 9.1~12.0 min, 90%A。柱温:40 ℃; 流速:0.4 mL/min, 进样量:1 μL。

离子源:电喷雾离子(ESI+和ESI-)源; 多反应监测(MRM)模式; 干燥气温度:200 ℃; 干燥气流速:14 L/min; 毛细管电压:3.5 kV; 毛细管出口电压(fragmentor): 380 V; 校准方法:质量轴自动调谐校正。MRM进行分段扫描:0~4.50 min, 水杨酸; 4.50~6.00 min, 吡罗昔康; 6.00~7.50 min, 萘普生; 7.50~8.85 min, 吲哚美辛、双氯芬酸钠和布洛芬; 8.85~12.00 min, 保泰松。其他质谱参数详见表 1

表 1 7种非选择性COX抑制药物的质谱参数 Table 1 MS parameters of the seven non-selective cyclooxygenase (COX) inhibitors
2 结果与讨论
2.1 质谱和色谱条件的优化

将7种非选择性COX抑制药物的标准品溶液(1 mg/L)直接进样, 分别在ESI+和ESI-两种模式下进行一级质谱扫描, 结果表明, 水杨酸、萘普生、吲哚美辛、双氯芬酸钠、布洛芬在ESI-模式下的响应比较高, 而吡罗昔康和保泰松两种成分在ESI+模式下的灵敏度较高。得到7种化合物精确的母离子质荷比, 优化毛细管电压。进一步对7种非选择性COX抑制药物的二级质谱参数进行优化, 选择信号强度较大的2个碎片离子为特征子离子, 其中相对丰度最强的为定量离子, 其次为定性离子, 以MRM模式进行扫描, 详细参数见表 1。其中布洛芬的碎片离子只有一个, 所以采用一个离子通道对奶粉中的布洛芬进行分析。

考察了7种非选择性COX抑制药物在3组不同流动相下的色谱行为:(1)A为0.1%甲酸水溶液, B为0.1%甲酸甲醇; (2)A为0.1%甲酸水溶液, B为0.1%甲酸乙腈; (3)A为0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L甲酸铵), B为0.1%甲酸乙腈。研究发现, 在流动相(1)条件下, 7种非选择性COX抑制药物的分析时间过长, 超过30 min, 而且色谱峰峰形较差; 在流动相(2)条件下, 7种非选择性COX抑制药物的分析时间短, 各组分色谱峰峰形较好, 灵敏度满足要求。本文考虑到7种非选择性COX抑制药物中除了吡罗昔康和保泰松, 其余5种均为是ESI-模式检测, 因此在0.1%甲酸水溶液中加入5 mmol/L的甲酸铵(即流动相(3)), 来提高负离子模式检测的5种非选择性COX抑制药物的离子化程度, 结果发现效果不明显, 而且会造成吡罗昔康和保泰松的色谱峰严重拖尾的现象, 所以将0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈作为分析7种非选择性COX抑制药物的流动相体系。

复溶溶剂的比例也会影响残渣中非选择性COX抑制药物的色谱行为和回收率, 本文采用0.1%甲酸水溶液-乙腈作为复溶溶剂。对复溶溶剂中乙腈的体积分数(分别为10%、50%和90%)进行了考察, 结果表明, 当乙腈体积分数为10%时, 残渣中保泰松的溶解度较小, 回收率较低; 当乙腈体积分数为90%时, 7种非选择性COX抑制药物的色谱峰会出现前倾和分叉峰; 当乙腈体积分数为50%时, 7种非选择性COX抑制药物的检测灵敏度最高, 色谱峰峰形较好, 因此本文采用0.1%甲酸水-乙腈(1: 1, v/v)作为残渣中7种非选择性COX抑制药物的复溶溶剂。7种非选择性COX抑制药物的MRM谱图见图 1

图 1 7种非选择性COX抑制药物(20 μg/L)的MRM谱图 Fig. 1 MRM chromatograms of the seven non-selective COX inhibitors (20 μg/L)
2.2 提取方式的优化

非选择性COX抑制药物常用的提取剂是甲醇和乙腈, 除了其高效的提取效率之外, 还具有净化效果, 可以去除样品中的部分蛋白质。有文献[21]报道用5%甲酸乙腈(酸化乙腈)提取牛乳中的非选择性COX抑制药物, 提取效率较高, 但是由于酸化乙腈仅仅对极性较强的化合物提取效果好, 对于弱极性或者非极性化合物的提取效率一般。有文献[8]采用乙腈-乙酸乙酯(1: 1, v/v)溶液提取牛乳中的非选择性COX抑制药物, 因为乙酸乙酯能够提高弱极性或者非极性化合物(包括保泰松、萘普生、吡罗昔康、布洛芬和吲哚美辛)提取效率。所以本文将乙腈-乙酸乙酯(1: 1, v/v)溶液作为奶粉中非选择性COX抑制药物的提取溶剂。有研究[16]发现保泰松在前处理过程中容易被氧化, 回收率和重现性不高, 需要在提取过程中加入一定量的抗坏血酸来防止保泰松的氧化。也有研究[21]表明, 在提取过程中加入高浓度(0.1 mol/L)的抗坏血酸, 会导致萘普生回收率降低, 且并不能显著提高保泰松的回收率, 同时会污染质谱系统。所以本文将抗坏血酸的浓度降至0.01 mol/L, 并用1 mol/L盐酸溶液将pH调至2.5, 结果表明, 采用0.01 mol/L pH 2.5的抗坏血酸溶液-乙酸乙酯-乙腈(2: 5: 5, v/v/v)组成的提取溶剂提取质控样品中7种非选择性COX抑制药物, 保泰松的提取效率最高, 而且不影响其他6种化合物的提取效率。提取溶剂的酸化处理(加入pH 2.5的抗坏血酸)能充分去除提取溶液中的蛋白质, 还能增加非选择性COX抑制药物的pKa值, 促进其质子化作用[8]。不同提取溶剂对奶粉中7种非选择性COX抑制药物的提取效率见图 2

图 2 不同提取溶剂对质控样品中7种非选择性COX抑制药物的提取效率 Fig. 2 Extraction recoveries using different extraction solutions in quality-control samples Solvent 1: 5% (volume percentage) formic acid acetonitrile solution; solvent 2: acetonitrile-ethyl acetate (1: 1, v/v); solvent 3: 0.01 mol/L pH 2.5 ascorbic acid-acetonitrile-ethyl acetate (2: 5: 5, v/v/v).
2.3 净化方式的优化

有报道[13]将牛乳中的非选择性COX抑制药物经甲醇提取后直接进样, 但是考虑到奶粉中高含量的脂类物质, 会引起基质效应, 影响检测灵敏度, 污染色谱和质谱系统, 所以有必要对提取溶液进行净化处理。检测奶制品中的非选择性COX抑制药物的净化步骤一般采用两种方式:液液萃取净化和固相萃取小柱净化(SPE)[18, 23]。Peng等[8]用正己烷去除提取液中的脂类物质。而最常用的净化方式是用SPE固相萃取小柱, 已有的文献[22]采用C18、亲水亲脂共平衡的大孔聚合物(HLB)、混合型阳离子交换树脂(MCX)等填料的固相萃取小柱去除样品中的脂类物质, 但Dubreil-Chéneau等[13]用固相萃取小柱净化后, 发现结果重现性很差。

本文采用分散固相萃取对提取溶液进行净化, 采用无水硫酸钠、C18-N及NH2-PSA 3种净化剂, 对其用量进行正交试验优化。无水硫酸钠、C18-N及NH2-PSA用量分别作为因素A、B、C, 每个因素取3个水平, 按照L9(33)正交表试验, 比较质控样品在各因素组合下的回收率和净化效果, 来选择最佳配比组合(见表 2)。结果表明, 使用1 000 mg无水硫酸钠、300 mg C18-N以及100 mg NH2-PSA组成的净化剂可以获得良好的净化效果。

表 2 无水硫酸钠、C18-N及NH2-PSA用量的正交试验因素水平 Table 2 Orthogonal test factors and levels of the dosages of Na2SO4, C18-N, and NH2-PSA

本文通过比较分散固相萃取、正己烷液液萃取和固相萃取(采用C18、HLB、MCX等3种填料)等3种净化方式, 发现质控样品的净化效率差别不大。考虑到实验的成本、效率和结果的重现性, 最终选择分散固相萃取作为检测奶粉中7种非选择性COX抑制药物的净化方式。

2.4 基质效应考察

样品前处理过程中, 除了目标化合物, 还有其他同时提取出来的干扰成分, 这些共流出组分会影响目标化合物的分离并干扰其离子化, 引起检测信号的减弱或增强, 最终影响定量的准确性, 这就是基质效应(ME)。一般用基质标准曲线的斜率与溶剂标准曲线的斜率之比作为ME, 评价前处理的净化效率。一般情况下, ME在85%~115%之间不存在明显的基质效应。本文采用空白奶粉的提取溶液作为基质, 分别精密加入适当体积的混合标准中间溶液, 配制成水杨酸、吲哚美辛、吡罗昔康和保泰松的线性范围为5~200 μg/L以及萘普生、双氯芬酸钠和布洛芬的线性范围为10~200 μg/L的基质匹配标准工作液; 溶剂混合标准工作溶液配制见1.2节。按1.5节仪器条件进行分析, 得到基质标准曲线和溶剂标准曲线, 结果ME为77.6%~87.1%, 表明存在基质抑制效应, 为消除或减弱基质效应干扰, 本文采用相应空白基质溶液配制标准溶液绘制校正曲线。

2.5 线性关系、定量限及重复性

取2.4节中已配制的基质匹配标准工作液, 分别进样1 μL, 以定量离子峰面积(Y)为纵坐标、标准品质量浓度(X, μg/L)为横坐标进行线性回归, 得到线性方程、线性范围和相关系数。结果表明, 各组分在线性范围内线性关系良好, 相关系数(r2)均大于0.995 7。

取2.0 g空白样品(检测结果为阴性的奶粉), 加入适当稀释的混合标准中间溶液, 按1.4节方法进行前处理, 按1.5节方法进行分析。如表 3所示, 以定量离子对的信噪比(S/N)=3为检出限(LOD)、S/N=10为定量限(LOQ), 得到检出限范围为0.5~2 μg/g, 定量限范围为2~5 μg/g。

表 3 7种非选择性COX抑制药物的线性范围、线性方程、r2、检出限和定量限 Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LODs, and LOQs of the seven non-selective COX inhibitors
2.6 方法回收率与精密度

取2.0 g空白样品(检测结果为阴性的奶粉), 添加低、中、高3个水平(详见表 4), 每个水平有6份样品, 回收率和精密度试验结果见表 4。7种非选择性COX抑制药物的3个浓度水平的平均回收率为76.4%~89.8%, 相对偏差为2.1%~7.9%。

表 4 奶粉中7种非选择性COX抑制药物的回收率与精密度试验(n=6) Table 4 Recoveries and precisions of the seven non-selective COX inhibitors in milk powder (n=6)
2.7 实际样品检测

用本方法完成了40批次奶粉(均来自2017年度杭州地区奶粉专项抽检)的检测, 结果均未检出7种非选择性COX抑制药物。

3 结语

本文建立了分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱测定奶粉中7种非选择性COX抑制药物残留的方法, 优化了色谱、质谱、提取和净化条件。与传统固相萃取技术相比, 该方法更加简便、经济、高效, 能够满足日常大批量奶粉检测的需求。

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