色谱  2019, Vol. 37 Issue (6): 612-618     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.12026   PDF    
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范广宇
唐秀
张云青
孟祥龙
梁振纲
高效液相色谱-串联质谱法同时测定贝类中22种农药残留
范广宇1, 唐秀1, 张云青1, 孟祥龙1, 梁振纲2     
1. 连云港海关, 江苏 连云港 222042;
2. 海南出入境检验检疫局技术中心, 海南 海口 570311
摘要:建立了高效液相色谱-三重四极杆质谱(HPLC-MS/MS)同时测定贝类中22种农药残留的分析方法。样品经含0.1%(v/v)甲酸的乙腈提取,N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳黑(GCB)净化,然后采用ACE UltraCore 2.5 SuperC18柱(100 mm×2.1 mm,2.5 μm)分离,以甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速为0.4 mL/min,柱温为35 ℃,然后以电喷雾电离(ESI)源,在多反应监测(MRM)、正离子模式下,采用三重四极杆质谱检测。22种农药在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数均大于0.997,检出限为0.1~0.3 μg/kg,定量限为0.3~1.0 μg/kg。在3个添加水平下,22种农药的平均回收率为65.2%~109.4%,相对标准偏差为1.3%~15.2%(n=6)。该方法操作简单,快速,准确度高,灵敏度高,可用于贝类中22种农药残留的同时检测。
关键词高效液相色谱    三重四极杆质谱    农药残留    贝类    
Determination of 22 pesticide residues in shellfish by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
FAN Guangyu1, TANG Xiu1, ZHANG Yunqing1, MENG Xianglong1, LIANG Zhengang2     
1. Lianyungang Customs, Lianyungang 222042, China;
2. Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Haikou 570311, China
Foundation item: Science and Technology Plan Project of Nanjing Customs (No. 2017KJ12); Emergency Support Plan of General Administration of Customs (No. 2018IK048)
Abstract: A method for the simultaneous determination of 22 pesticide residues in shellfish by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was developed. The pesticides in the samples were extracted with 0.1% (v/v) formic acid in acetonitrile, cleaned up with primary secondary amine (PSA) and graphitized carbon black (GCB), and then separated on an ACE UltraCore 2.5 Super C18 column (100 mm×2.1 mm, 2.5 μm) by elution with a methanol-0.1% (v/v) formic acid solution at a flow rate of 0.4 mL/min. The analytes were detected by electrospray ionization in the positive ion mode and the multiple reaction monitoring mode. Good linear relationships were obtained, and the correlation coefficients (r2) of the 22 pesticides were all higher than 0.997. The limits of detection and limits of quantification were 0.1-0.3 μg/kg and 0.3-1.0 μg/kg, respectively. The mean recoveries varied from 65.2% to 109.4% at three spiked levels, and the relative standard deviations ranged from 1.3% to 15.2% (n=6). The proposed method is simple, accurate, and sensitive, and is effective for the simultaneous determination of 22 pesticide residues detected in shellfish.
Key words: high-performance liquid chromatography (HPLC)     triple quadrupole mass spectrometry (MS/MS)     pesticide residues     shellfish    

随着现代化学工业的发展, 大量的农药被投入到农业生产中, 为农作物的产量提高发挥了巨大作用。但是, 农药残留污染也成为一个值得重视的问题。农药不仅可能残留于农产品中, 同时也会进入环境水体中。国内外的一些研究[1-4]已经发现, 多种除草剂和杀虫剂在环境水体中均有检出, 如莠去津、西玛津、扑草净和毒死蜱等。这表明, 在环境水体中除草剂和有机磷类杀虫剂的残留污染普遍存在, 这些进入环境水体中的农药会在水生动物体内残留和富集。贝类一般捕食水体中的微小生物, 极易富集海洋水体中残留的农药[5], 最终通过食物链影响到人类的健康。同时, 在近海养殖中, 一些贝类养殖户采用三唑磷等杀虫剂作为清塘剂来杀死鱼虾、保护贝类种苗。海边大量鱼虾死亡的报道时有发生[6]。因此, 贝类中除草剂和有机磷类杀虫剂等农药残留风险较高, 需要建立准确快速的检测方法监控这些农药残留风险。

目前, 对于水产品中农药残留采用的前处理方法主要有固相萃取法[7, 8]、凝胶渗透色谱法[9-11]和QuEChERS法[12-14]等, 检测方法主要有气相色谱法[7, 8, 15]、气相色谱-质谱法[10-12]、液相色谱-质谱法[9, 13, 14, 16, 17]等。贝类中农药的检测方法的报道主要集中在有机氯、多氯联苯等, 同时检测贝类中除草剂和有机磷杀虫剂的报道较少。QuEChERS法因为其快速、简便、安全和成本低等而得名, 近几年广泛应用到农药、兽药等污染物的检测中[18]。本研究基于QuEChERS法和高效液相色谱-质谱, 建立了一种同时检测贝类中22种农药残留的方法。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

QTRAP 4500液相色谱-串联质谱仪(美国AB SCIEX公司); Analyst工作站; XS 204分析天平(瑞士Mettler公司); A10 Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司); TDL-40B型离心机(上海安亭科学仪器厂); XW-80A型漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)。

西草净(simetryn)、敌草净(desmetryn)、扑灭通(prometon)、特丁通(terbumeton)、草净津(cyanazine)、西玛津(simazine)、环嗪酮(hexazinone)、莠灭净(ametryn)、环丙津(cyprazine)、莠去津(atrazine)、吡唑草胺(metazachlor)、扑草净(prometryn)、特丁净(terbutryn)、扑灭津(propazine)、异丙净(dipropetryn)、异戊乙净(dimethametryn)、特丁津(terbuthylazine)农药标准品(纯度>97%)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司, 乐果(dimethoate)、三唑磷(triazophos)、对硫磷(parathion)、丙草胺(pretilachlor)、毒死蜱(chlorpyrifos)农药标准品(100 mg/L)购自农业部环境保护科研监测所。N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化炭黑(GCB)(美国Agilent公司); 甲醇和乙腈均为色谱纯(德国Merck公司); 氯化钠、无水硫酸镁、甲酸和乙酸为优级纯(中国国药试剂公司)。实验用水为超纯水。样品购自本地市场。

1.2 标准溶液的制备

标准储备液:分别准确称取农药标准品, 用乙腈溶解、定容, 配制成100 mg/L的标准储备液, 于-18 ℃储存。混合标准溶液:分别吸取标准储备液, 用乙腈稀释, 配制成1 mg/L的混合标准溶液, 于-18 ℃储存。使用前用乙腈稀释至所需浓度。

1.3 样品处理方法

准确称取10.0 g样品于50 mL离心管中。加入10 mL含0.1%(v/v)甲酸的乙腈, 涡旋混合30 s。加入1 g NaCl和4 g MgSO4, 涡旋混合2 min。离心后取1 mL上清液, 置于装有50 mg PSA和20 mg GCB的试管中, 涡旋混合1 min。以4 500 r/min离心10 min, 取上清液过0.22 μm滤膜后, 上机测定。

1.4 色谱条件

色谱柱:ACE UltraCore 2.5 Super C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm); 柱温:35 ℃; 流速:0.4 mL/min; 流动相:A为0.1%(v/v)甲酸水溶液, B为甲醇。梯度洗脱程序:0~1 min, 10%B; 1~2 min, 10%B~40%B; 2~16 min, 40%B~95%B; 16~18 min, 95%B; 18~18.1 min, 95%B~10%B; 18.1~20 min, 10%B。进样体积:5 μL。

1.5 质谱条件

离子源为电喷雾电离(ESI)源; 多反应监测(MRM)、正离子模式; 实验中所用的气体均为高纯氮气; 碰撞气(CAD)压力为41.4 kPa; 气帘气(CUR)压力为207 kPa; 雾化气(GS1)压力为414 kPa; 辅助气(GS2)压力为379 kPa; 电喷雾电压(IS)为5.5 kV; 去溶剂温度(TEM)为650 ℃; 入口电压(EP)为10 V; 碰撞室出口电压(CXP)为10 V。22种农药的保留时间、监测离子对、碰撞电压(CE)和去簇电压(DP)见表 1

表 1 22种农药的保留时间、监测离子对、碰撞电压和去簇电压 Table 1 Retention times, monitoring ion pairs, collision energies (CE) and declustering potentials (DP) of the 22 pesticides
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化

配制22种农药的标准溶液(0.1 mg/L), 采用注射泵直接进样的方式注入质谱仪。采用ESI+方式进行一级质谱分析, 确定母离子[M+H]+, 优化DP。对母离子进行二级质谱扫描, 优化CE, 选择两个相对丰度较高且稳定的特征碎片离子作为定量定性离子。优化后的质谱参数见表 1

2.2 色谱条件的优化

目标化合物分别属于三嗪类、酰胺类除草剂和有机磷类杀虫剂, 化学结构差异较大, 同时存在同分异构体, 对于色谱分离条件要求较高。本实验采用ACE UltraCore 2.5 SuperC18柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)对目标化合物进行分离, 梯度洗脱。考察了甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液和甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动性时, 目标化合物的分离效果和色谱峰形。结果表明, 当采用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液时, 色谱峰分离效果不好, 多个物质同时段出峰; 当采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液和甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液时, 各物质分离度较好; 但采用前者时各物质的峰高为后者的3倍, 可能是因为流动相含有酸时更有利于[M+H]+形成。因此本研究最终选择甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相进行分离。

在优化的条件下, 22种农药的提取离子色谱图见图 1

图 1 22种农药的提取离子色谱图 Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 22 pesticides
2.3 提取剂的优化

提取方法参照QuEChERS法, 分别研究了甲醇、乙腈、含0.1%(v/v)甲酸的乙腈和含0.1%(v/v)乙酸的乙腈作为提取剂时, 各目标物的提取效果。甲醇作提取剂时上清液浑浊, 添加回收率均低于70%;而采用乙腈提取时, 回收率均可以达到70%~120%;含0.1%(v/v)甲酸的乙腈和含0.1%(v/v)乙酸的乙腈提取时, 与乙腈提取的回收率相当; 但含0.1%(v/v)甲酸的乙腈提取液的峰形更好。因此选择含0.1%(v/v)甲酸的乙腈作为提取溶剂。

2.4 净化材料的优化

QuEChERS法多采用PSA作为净化材料, 本实验同时加入GCB, 去除提取液的色素。分别对PSA和GCB的使用量进行了优化。在添加量为2 μg/kg时, 分别比较使用不同用量的PSA对目标化合物回收率的影响, 结果见图 2。不添加PSA净化时, 目标化合物回收率低于70%的偏多; 而当使用量为50 mg以上时, 所有化合物的回收率均在70%~120%之间。可能是PSA用量少时, 存在的共萃取干扰物对目标化合物的响应产生了影响。单独用PSA净化后的水产品样品溶液呈黄色, 为除去色素, 加入GCB, 考察其对目标化合物回收率的影响。加入20 mg GCB净化后, 提取液变为基本无色透明的溶液, 回收率也全部在70%~120%之间。同时发现, 当GCB使用量超过30 mg后, 多数农药回收率均有降低趋势。因此, 选择采用50 mg PSA和20 mg GCB共同净化提取液。

图 2 经PSA和GCB净化后22种农药的回收率分布 Fig. 2 Recovery distribution of the 22 pesticides cleaned up by primary secondary amine (PSA) and graphitized carbon black (GCB)
2.5 基质效应考察

为了考察基质效应(matrix effects, ME)的影响, 按照1.3节分别对文蛤、扇贝、赤贝和青蛤4种贝类样品进行前处理, 配制基质匹配标准溶液, 同时采用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈配制相同系列浓度的标准溶液, 分别绘制标准曲线。按照下述公式进行计算:ME=[(基质匹配校准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率)-1]×100%。|ME|<20%为弱基质效应, 20%≤|ME|≤50%为中等基质效应, |ME|>50%为强基质效应[19]。弱基质效应可以忽略, 而中等基质效应和强基质效应则需采取基质匹配校正曲线等方法消除。计算结果显示, 22种农药在4种贝类样品中的|ME|均小于20%, 所以本研究中直接采用纯溶剂标准曲线。

2.6 方法学评价
2.6.1 线性关系、检出限和定量限

在优化的条件下, 配制22种农药质量浓度为0.25、0.5、1、5、10、50和100 μg/L的系列混合标准溶液, 以各农药定量离子的峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X, μg/L)为横坐标绘制标准曲线, 得到的线性回归方程和相关系数(r2)见表 2。22种农药在各自的线性范围内线性良好, 相关系数均大于0.997。以信噪比S/N≥3确定检出限(LOD), 以S/N≥10确定方法的定量限(LOQ), 结果见表 2

表 2 22种农药的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the 22 pesticides
2.6.2 精密度与回收率

采用空白文蛤样品, 分别在22种农药的定量限、2倍定量限和10倍定量限3个水平下进行添加回收试验。按照1.3节处理后, 每个水平重复测定6次。方法的回收率和精密度结果见表 3。3个添加水平下, 22种农药的平均回收率为65.2%~109.4%, 相对标准偏差为1.3%~15.2%(n=6)。

表 3 22种农药的回收率和精密度(n=6) Table 3 Recoveries and precisions of the 22 pesticides (n=6)
2.7 实际样品的测定

将本方法应用于20批样品(其中文蛤8批、扇贝6批、赤贝4批和青蛤2批)的检测, 其中16批次有不同程度的检出(>LOD)。毒死蜱、莠去津、扑草净、三唑磷和西玛津的检出率较高, 分别为70%、65%、65%、25%和25%, 含量范围分别为0.5~13.7、0.1~3.7、0.3~11.0, 0.5~2.5和0.3~0.8 μg/kg。从结果可以看出, 贝类中这些农药残留的风险较高。但最新的国家标准《食品中农药最大残留限量》[20]中还没有对贝类中的这些农药残留制定限量要求, 国际食品法典委员会(CAC)、欧盟和美国等组织、国家和地区也没有相关的限量要求, 仅日本根据一律标准按照0.01 mg/kg的限量要求。因而需要更加全面地研究来评估潜在的风险。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱-三重四极杆质谱检测贝类样品中22种农药残留的分析方法。贝类样品采用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈提取, PSA和GCB净化, 然后采用高效液相色谱-三重四极杆质谱法检测。将该方法应用于贝类样品检测, 检出多种农药残留。该方法样品前处理简单, 分析速度快, 精密度和灵敏度高, 能够同时测定水产品中22种农药残留, 对于贝类中农药残留风险评估有良好的应用前景。

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