色谱  2019, Vol. 37 Issue (6): 661-665     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.12040   PDF    
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胡雯雯
陶建伟
王庆伟
李静
阎超
许旭
高精度定量毛细管电泳法同时测定复合维生素B片中B1、B2、B6、烟酰胺及泛酸钙
胡雯雯1, 陶建伟1, 王庆伟1, 李静2, 阎超2,3, 许旭1     
1. 上海应用技术大学化学与环境工程学院, 上海 201418;
2. 上海通微分析技术有限公司, 上海 201203;
3. 上海交通大学药学院, 上海 200240
摘要:建立了高精度定量毛细管电泳法同时测定复合维生素B片中维生素B1、B2、B6、烟酰胺和泛酸钙的方法。样品经乙腈-水(20:80,v/v)超声提取后,采用全自动高精度定量毛细管电泳仪,以高精度进样阀定量进样,以40 mmol/L硼砂-硼酸缓冲液(pH 9.0)为背景电解质溶液,以工作电压为-10 kV电泳分离。维生素B1、B2、B6、烟酰胺的检测波长为280 nm,然后切换至检测波长210 nm检测泛酸钙。结果表明,各组分之间均得到良好分离,峰面积日内重复性(RSD)为1.3%~1.9%,显著优于普通毛细管电泳。维生素B1、B2、B6、烟酰胺及泛酸钙的浓度在各自线性范围内的相关系数(r)为0.9968~0.9998,检出限2.5~36.0 mg/L,平均回收率为94.1%~98.9%。该法准确可靠,可用于实际复合维生素B片中维生素B1、B2、B6、烟酰胺和泛酸钙含量的同时测定。
关键词毛细管电泳    复合维生素B片    含量测定    
Simultaneous determination of vitamins B1, B2, B6, niacinamide and calcium pantothenate in compound vitamin B tablets by high performance quantitative capillary electrophoresis
HU Wenwen1, TAO Jianwei1, WANG Qingwei1, LI Jing2, YAN Chao2,3, XU Xu1     
1. School of Chemical and Environmental Engineering, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China;
2. Unimicro Technologies, Inc., Shanghai 201203, China;
3. Pharmacy School, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China
Abstract: A high performance quantitative capillary electrophoresis method was developed for the simultaneous determination of vitamins B1, B2, B6, nicotinamide, and calcium pantothenate in vitamin B tablets using a quantitative capillary electrophoresis instrument. The samples were extracted ultrasonically with acetonitrile-water (20:80, v/v). The automatic high precision quantitative capillary electrophoresis instrument was used to realize quantitative injection through a 10 nL injection valve. The background electrolyte was selected as 40 mmol/L sodium borate buffer (pH 9.0), which was continuously supplied by a microfluidic injection pump. The working voltage was -10 kV. The detection wavelength of vitamins B1, B2, B6, and nicotinamide was selected as 280 nm, which was then changed to 210 nm to detect calcium pantothenate. The result showed good linearities between the peak area and the concentration of vitamins B1, B2, B6, nicotinamide, and calcium pantothenate in the correlation coefficients (r) range of 0.9968-0.9998. The limits of detection (LODs) were in the range of 2.5-36.0 mg/L. The average recoveries were 94.1%-98.9% with relative standard deviations (RSDs) as 1.3%-1.9%. The method is precise, reliable, and suitable for the simultaneous determination of vitamins B1, B2, B6, nicotinamide, and calcium pantothenate in a real compound vitamin B tablet.
Key words: capillary electrophoresis (CE)     compound vitamin B tablets     content determination    

复合维生素B片主要用于预防和治疗B族维生素缺乏所致的营养不良、厌食、脚气病、糖尿病等。按照卫生部标准WS1-73(B)-89[1], 每片复合维生素B片含5种B族维生素的量为:维生素B1 3 mg, 维生素B2 1.5 mg, 烟酰胺10 mg, 维生素B6 0.2 mg, 右旋泛酸钙1 mg。按照标准分别采用重量法测定维生素B1的含量, 紫外分光光度法测定维生素B2的含量, 滴定法测定烟酰胺的含量。该操作繁琐, 且没有维生素B6和泛酸钙的含量测定方法。

文献报道中复合维生素B片的含量测定多采用HPLC法、毛细管电泳法、LC-MS联用法以及定量核磁共振波谱法。采用HPLC法[2-8]测定复合维生素B片中维生素成分的含量时, 其中泛酸钙的含量测定方法较少提及, 仅徐硕等[9]报道了HPLC同时测定一种进口复合维生素B片中这5种维生素含量的方法。本实验室[10]建立了用定量核磁共振波谱测定复合维生素B片中除维生素B6的4种成分含量的方法。Eiff等[11]用定量核磁共振法分析水溶性和脂溶性维生素, 但未对维生素B2进行定量分析。也有采用LC-MS法对B族水溶性维生素进行分析的报道[12, 13]。毛细管电泳法测定的复合维生素B片中的成分主要是维生素B1、烟酰胺、维生素B2和维生素B6, 也均未涉及泛酸钙含量的测定, 且通常测定精密度不高。Huopalahti等[14]采用区带电泳法测定各组分峰面积的RSDs为2.1%~6.3%。Boonkerd等[15]针对精密度问题还使用了内标物质进行校正计算。另外一些使用普通毛细管电泳仪测定复合维生素B片的文献报道中精密度(RSD)分别为3.5%~4.8%[16]和1.8%~4.7%[17]

高精度定量毛细管电泳仪通过引入具有精确内部定量环的nL级进样阀, 改善了进样体积精度, 配合相应的自动进样控制系统和毛细管温控系统, 有助于提高毛细管电泳的定量重复性和准确度[18, 19]。本研究使用高精度定量毛细管电泳仪, 建立了高精度同时测定复合维生素B片中5种维生素含量的方法, 获得了较好的定量精密度。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

高精度定量毛细管电泳仪包括自动进样器、紫外检测器、高压电源、微流注射泵、四通进样阀及qSepTM-3010色谱工作站(上海通微分析技术有限公司)。精密天平(M2P型, 精度为0.001 mg, 德国Sartorius公司)。带有电隔离槽的石英毛细管(进样端带隔离槽, 内径75 μm, 总长度65 cm, 有效长度45 cm, 上海通微分析技术有限公司)。

维生素B1(盐酸硫胺素, 含量98%)、维生素B2(核黄素, 含量98%)、烟酰胺(含量99%)均购自上海阿达玛斯试剂有限公司; 泛酸钙对照品(含量97.5%)购自中国药品生物制品检定院; 维生素B6(盐酸吡多辛, HPLC级, 含量98%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 十水合四硼酸钠和硼酸均为分析纯, 购自上海国药试剂有限公司; 乙腈(HPLC级)购自上海泰坦科技有限公司; 蒸馏水购自屈臣氏; 复合维生素B片药品均购自上海零售药房。

1.2 样品预处理

取10片复合维生素B片, 计算平均片重, 置研钵中研成细粉, 从中取0.43 g样品置于10 mL离心管中, 加9 mL乙腈-水(20:80, v/v), 涡旋振荡2 min, 在60 ℃超声提取至溶液中粉末为白色, 在3000 r/min条件下离心3 min后取上清液, 过0.22 μm水相滤膜, 得到复合维生素B片提取溶液。

5种维生素均用乙腈-水(20:80, v/v)配制混合储备溶液, 其维生素B1、B2、B6、烟酰胺和泛酸钙的质量浓度分别为5.04、1.07、2.71、16.46和5.19 g/L。混合储备溶液分别用乙腈-水(20:80, v/v)稀释1、2、5、10、25和50倍, 配制成混合维生素样品溶液。

1.3 毛细管电泳实验

新毛细管按其使用说明用超纯水冲洗30 min, 每次实验前用pH 9.0硼砂-硼酸缓冲液冲洗毛细管柱30 min, 两次进样间隔使用冲洗程序清洗进样针头和进样管路, 实验当天完成样品分析后用流速为0.8 μL/min的乙腈-水(10:90, v/v)冲洗毛细管柱至少1 h。

分离缓冲液为40 mmol/L pH 9.0硼砂-硼酸缓冲液。分离过程中注射泵以1.0 μL/min的流速持续通入分离缓冲液, 该分离缓冲液分流后通过分离毛细管。进样电压为-10 kV。进样量为10 nL(定量阀自动进样)。没有使用毛细管柱温控制系统。检测波长在10 min内为280 nm, 用于检测维生素B1、B2、B6和烟酰胺, 10 min以后转换为210 nm, 用于检测泛酸钙。

2 结果与讨论
2.1 毛细管电泳分离结果

使用选定的毛细管电泳条件, 混合维生素样品溶液和复合维生素B片提取溶液中各成分可在15 min内完全分离, 结果见图 1

图 1 (a) 5种维生素混合溶液和(b)复合维生素B片提取溶液的电泳图 Fig. 1 Electrophoregrams of (a) the mixture of five vitamins and (b) multivitamin B tablet extract solution Peak Nos: 1. vitamin B1(thiamin); 2. nicotinamide; 3. vitamin B2(riboflavin); 4. vitamin B6(pyridoxine); 5. pantothenate.
2.2 样品提取溶剂的选择

维生素B1、B6、烟酰胺和泛酸钙的水溶性较好。维生素B2微溶于水, 尽管在碱性溶液中容易溶解, 但维生素B1和B6在碱液中易被破坏。可通过添加乙腈[15]提高维生素B2的溶解性, 并可保证其他4种维生素均可溶解。试验比较了不同比例乙腈的提取效果, 使用10%(体积分数, 下同)乙腈提取时, 维生素B2的测定结果偏低; 而使用高于20%的乙腈提取时, 含量测定结果基本不变。考虑到纯乙腈可能影响后面的毛细管电泳分离, 故提取溶剂选择为乙腈-水(20:80, v/v)。样品预处理方法见1.2节。

2.3 缓冲液浓度的影响

缓冲液浓度是影响分析物迁移行为的重要因素。随着硼砂缓冲液浓度的增加, 5种分析物的迁移时间不断增大(见图 2a), 其分离度(见图 2b)和峰形也越来越好, 并在40 mmol/L时获得了最好的分离效果。继续增大缓冲液浓度至50 mmol/L, 电流较大, 较高的电流会产生大量的焦耳热, 导致基线不平、分离效率下降。故最终确定硼砂缓冲液的浓度为40 mmol/L。

图 2 缓冲液浓度对(a)迁移时间和(b)分离度的影响 Fig. 2 Effects of buffer concentrations on (a) migration time and (b) resolution The subscripted number after R is the peak number of the two adjacent peaks in Fig. 1.
2.4 缓冲液pH的影响

缓冲液pH是影响分离及电渗的关键因素。考察了缓冲液不同pH值对分离的影响, 结果见图 3。在pH 9.0时5种成分可在较短的迁移时间实现完全分离。当pH继续增大, 电流上升, 焦耳热增大引起区带展宽, 导致最后两个峰(维生素B2和泛酸钙)的分离度变差。

图 3 pH对(a)迁移时间和(b)分离度的影响 Fig. 3 Effects of pH on (a) migration time and (b) resolution
2.5 分离电压的影响

电压越高, 分离时间越短, 但在高压下焦耳热会增大引起峰展宽。比较了电压为-5、-8、-10、-15 kV(相应的电流在13到48 μA)的效果, 结果在较低电压(-5和-8 kV)时, 分离时间较长, 维生素B2和B6不能完全分开。在-10 kV电压下, 5种成分完全分离。

2.6 检测波长的选择

文献[2, 5, 9, 20]报道维生素B1、B2、B6和烟酰胺可在266、270、275、280 nm处进行紫外检测, 试验比较了266~280 nm处的检测效果。结果显示, 波长增大, 烟酰胺峰高减小, 维生素B6峰高增大。实际样品中因烟酰胺含量高, 而维生素B6含量低, 故选择280 nm作为检测波长。泛酸钙仅在低波长处有末端吸收, 故选择210 nm作为其检测波长。由于9.5 min时, 前面4种物质已完成分离, 而泛酸钙在10.5 min以后才开始出峰, 因此使用波长转换的程序设置, 前10 min的检测波长设置为280 nm, 在10 min时转换波长为210 nm以检测泛酸钙。

2.7 添加剂的影响

为了控制电渗、改善分离选择性以及减少毛细管内壁吸附, 考察了在缓冲液中加入羟丙基-β-环糊精、乙腈、甜菜碱和EDTA的分离效果。结果显示, 缓冲液中加入这些添加剂对组分的迁移和分离并无明显改善。故没有使用添加剂。

2.8 毛细管柱温的影响

比较了室温(不控温)和恒温(20 ℃, 使用毛细管柱温控制系统)对峰面积重复性的影响, 结果恒温对精密度有改进, 但两者精密度RSD的最大值相差不大, 为操作方便, 使用不控温的室温实验。

2.9 方法学验证
2.9.1 线性关系和检出限

精密取一定量的对照品混合液配制6个不同浓度标准溶液, 以峰面积为纵坐标、质量浓度(g/L)为横坐标绘制标准曲线。结果(见表 1)表明, 5种化合物在实验浓度范围内呈现线性关系, 相关系数(r)为0.9968~0.9998。对标准溶液逐渐稀释, 取信噪比(S/N)为3时组分的质量浓度为检出限(LOD)。

表 1 5种组分的线性方程、相关系数、线性范围和检出限 Table 1 Linear equations, correlation coefficients (r), linear ranges, and LODs of the five components
2.9.2 精密度

配制维生素B1、烟酰胺、维生素B2、维生素B6和泛酸钙的标准混合溶液, 在一天8 h内重复测定6次, 维生素B1、烟酰胺、维生素B2、维生素B6和泛酸钙的峰面积日内RSD值分别为1.9%、1.4%、1.3%、1.7%和1.7%。文献中采用电泳法测定不同维生素的RSDs分别为2.1%~6.3%[14]、7%~10%(非内标校正方法)[15]、3.5%~4.8%[16]和1.8%~4.7%[17], 显示本方法及仪器精密度优于文献方法。

配制维生素B1、烟酰胺、维生素B2、维生素B6和泛酸钙的标准混合溶液, 连续测定6天, 计算日间精密度的峰面积RSDs值(n=6)在3.1%~5.7%之间, 低于上述日内精密度, 而且重复测定日内和日间精密度仍然如此。推测原因可能是过夜后有样品成分不稳定[21]。因此已配制溶液要在一天内完成测定。

2.9.3 回收率

分两批在已知含量的复合维生素B片中分别加入前3种组分(维生素B1、烟酰胺和维生素B2)和后2种组分(维生素B6和泛酸钙)的对照品, 分别进行6次平行试验。测定并计算各组分的平均回收率和RSDs, 结果见表 2。复合维生素B片的加标回收率为94.07%±5.30%~98.87%±3.99%, 相对标准偏差为2.9%~5.6%。

表 2 5种组分加标回收率和相对标准偏差(n=6) Table 2 Spiked recoveries and RSDs of the five components (n=6)
2.10 样品分析

用建立的方法对3个批次复合维生素B片进行含量测定, 每个样品测定2次, 取平均值, 根据取样量计算其相当于标示量的百分比, 结果见表 3

表 3 复合维生素B片样品测定结果相当于标示量的百分比(n=2) Table 3 Measurement results of multivitamin B samples equivalent to the percentage of the labeled amount (n=2)
3 结论

本文使用全自动定量毛细管电泳系统, 实现了复合维生素B片中维生素B1、B2、B6、烟酰胺和泛酸钙的分离和高精度含量测定。该方法简便快速、精密度好、准确可靠, 可用于复合维生素B片中维生素B1、B2、B6、烟酰胺和泛酸钙含量的同时测定。

参考文献
[1]
Chinese Pharmacopeia Commission. Drug Standard of Ministry of Public Health, Chemical Medicines and Preparations, Vol. 1. Beijing: Chinese Pharmacopeia Commission, 1989
中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准, 化学药品及制剂第一册.北京: 中华人民共和国卫生部药典委员会, 1989
[2]
Chen J Q, Wang J, He L H. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2012, 32(6): 1090.
陈金泉, 王军, 何立环. 药物分析杂志, 2012, 32(6): 1090.
[3]
Lu G R, Wang G Z. Journal of China Pharmaceutical University, 1995, 26(3): 177.
陆帼蓉, 王桂珍. 中国药科大学学报, 1995, 26(3): 177. doi :10.3321/j.issn:1000-5048.1995.03.015
[4]
Wu F, Xu H Y. China Medical Herald, 2007, 4(31): 95.
吴芳, 徐红艳. 中国医药导报, 2007, 4(31): 95. doi :10.3969/j.issn.1673-7210.2007.31.066
[5]
Zhang Y Y, Ding D Z. Journal of Pharmaceutical Research, 2017, 36(6): 327.
张媛媛, 丁大中. 药学研究, 2017, 36(6): 327.
[6]
Chen G L, Li Y L, Liu M, et al. Chinese Journal of Hospital Pharmacy, 2006, 26(10): 1256.
陈光龙, 李玉兰, 刘敏, 等. 中国医院药学杂志, 2006, 26(10): 1256. doi :10.3321/j.issn:1001-5213.2006.10.027
[7]
Liu X L, Wu G, Zhong H B. Chinese Pharmaceutical Affairs, 2003, 17(4): 241.
刘晓琳, 武谷, 钟淮滨. 中国药事, 2003, 17(4): 241. doi :10.3969/j.issn.1002-7777.2003.04.025
[8]
Wu H X, Zheng A N, Su C Y, et al. Chinese Journal of chromatography, 2017, 35(4): 439.
吴宏星, 郑艾妮, 苏草茵, 等. 色谱, 2017, 35(4): 439.
[9]
Xu S, Xu W F, Jin P F, et al. China Pharmacist, 2018, 21(1): 177.
徐硕, 徐文峰, 金鹏飞, 等. 中国药师, 2018, 21(1): 177. doi :10.3969/j.issn.1008-049X.2018.01.049
[10]
Guo Q S, Liu M K, Yu S, et al. Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2016, 33(3): 442.
郭强胜, 刘明珂, 禹珊, 等. 波谱学杂志, 2016, 33(3): 442.
[11]
Eiff J, Monakhova Y B, Diehl B W K. J Agric Food Chem, 2015, 63(12): 3135. doi :10.1021/acs.jafc.5b00087
[12]
Sim H, Kim B, Lee J. J AOAC Int, 2016, 99(5): 1223. doi :10.5740/jaoacint.16-0093
[13]
Chen P, Atkinson R, Wolf W R. J AOAC Int, 2009, 92(2): 680.
[14]
Huopalahti R, Sunell J. J Chromatogr A, 1993, 636: 133. doi :10.1016/0021-9673(93)80065-G
[15]
Boonkerd S, Detaevernier M R, Michotte Y. J Chromatogr A, 1994, 670: 209. doi :10.1016/0021-9673(94)80296-3
[16]
Pan Z W, Li Y Q, Chen Y L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2007, 25(4): 594.
潘仲巍, 李玉琴, 陈永雷, 等. 色谱, 2007, 25(4): 594. doi :10.3321/j.issn:1000-8713.2007.04.033
[17]
Si X Y, Tan H R, Shi T T, et al. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2008, 124(6): 112.
司雄元, 檀华蓉, 施婷婷, 等. 中国农学通报, 2008, 124(6): 112.
[18]
Ling B Z, Xu Y, Yao D, et al. Chromatographia, 2015, 78(7/8): 543.
[19]
Xu Y, Ling B Z, Zhu W J, et al. Biomed Chromatogr, 2016, 30(3): 390. doi :10.1002/bmc.v30.3
[20]
Han X M, Zu S C. Chinese Pharmaceutical Affairs, 2012, 26(8): 891.
韩秀梅, 祖述春. 中国药事, 2012, 26(8): 891. doi :10.3969/j.issn.1002-7777.2012.08.028
[21]
Xiao H, Yan K, Zheng Y T, et al. Chinese Journal of chromatography, 2018, 36(4): 381.
肖汉, Yan Kevin, 郑怡婷, 等. 色谱, 2018, 36(4): 381.