色谱  2019, Vol. 37 Issue (6): 597-604     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.12041   PDF    
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杜颖颖
刘相真
叶美君
徐建峰
高海燕
郑国建
超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中游离氨基酸成分
杜颖颖, 刘相真, 叶美君, 徐建峰, 高海燕, 郑国建     
中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院, 国家茶叶质量监督检验中心, 浙江 杭州 310016
摘要:建立了使用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)高效、快速直接测定茶叶中游离氨基酸的方法。通过对质谱、色谱条件及氨基酸提取条件的优化,以含0.2%(体积分数)甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱,在电喷雾离子(ESI)源正离子扫描模式下检测,通过UHPLC-MS/MS测定,共解析了茶叶中的20种氨基酸。结果表明,茶氨酸(Thea)、Arg、Asn和Asp在50~500 μg/L范围内线性关系良好,其他氨基酸在10~250 μg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.99;加标回收率为92.3%~109.2%,相对标准偏差为2.00%~9.88%,检出限为0.001~0.011 mg/L,定量限为0.010~0.053 mg/L。该方法灵敏、准确,具有良好的重复性和稳定性,可有效检测出茶叶中的20种氨基酸及氨基类成分。
关键词超高效液相色谱-串联质谱    游离氨基酸    茶叶    提取方法    
Detection of free amino acids in tea using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
DU Yingying, LIU Xiangzhen, YE Meijun, XU Jianfeng, GAO Haiyan, ZHENG Guojian     
Hangzhou Tea Research Institute, CHINA COOP, China National Center of Quality Supervision and Inspection of Tea, Hangzhou 310016, China
Foundation item: National Key Research and Development Plan (No. 2018YFF0214203); Application Research for Public Welfare Technology of Zhejiang Province (No. 2017C37066)
Abstract: To efficiently and quickly detect free amino acid components in tea, a method using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was developed. With the optimization of mass spectrometry, chromatographic conditions, and amino-acid extraction conditions, a total of 20 free amino acids were identified using 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.2% (v/v) formic acid and methanol as mobile phases for gradient elution and detected by electrospray ionization (ESI) and positive-ion scanning. The results showed that all calibration curves expressed good linearities. Theanine (Thea), Arg, Asn, and Asp were in the range of 50-500 μg/L. The other amino acids were in the range of 10-250 μg/L with all correlation coefficients ≥ 0.99. The average recoveries were between 92.3% and 109.2%. The relative standard deviation (RSDs) were between 2.00% and 9.88%. The limits of detection (LODs) were 0.001-0.011 mg/L, and the limits of quantification (LOQs) were 0.010-0.053 mg/L. The method is sensitive, accurate, and has good repeatability and stability. The method can effectively detect 20 types of amino acids and amino components in tea leaves from the samples of green tea, white tea, and black tea.
Key words: ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     free amino acids     tea     extraction method    

茶叶中的游离氨基酸是茶叶化学组分中的重要组成部分, 也是茶叶品质的重要评价因子之一。大多数氨基酸都存在D型和L型两种异构体, 其中L-氨基酸是人体重要营养物质[1]。茶叶中含有20多种L型游离氨基酸, 其组成和含量将直接影响茶叶的香气和滋味。其中茶叶特有的氨基酸茶氨酸具有类似味精的鲜爽和焦糖香气[2], 可缓解茶的苦涩味, 增强其甜味[3], 也是茶叶鲜爽滋味的主要来源, 其他的氨基酸也具有各自的风味特征。因此, 茶叶中L型游离氨基酸组分分析对于茶叶品质鉴定具有十分重要的意义。

对茶叶中游离氨基酸的检测方法一直在摸索与精进中。茚三酮比色法是目前测定游离氨基酸总量的常规方法, 也是国标《茶游离氨基酸总量测定》中所采用的检测方法[4], 但该法只适用于茶叶中游离氨基酸总量的测定, 不能检测茶叶中各游离氨基酸组分的含量。氨基酸自动分析仪法应用于茶叶中氨基酸的检测已有多年历史[5-8], 但存在设备价格及仪器局限性等问题[9, 10]。经过多年发展, 柱前衍生-高效液相色谱(HPLC)法已经取得了长足的进步, 其测定精密度和准确性正向离子交换法逼近, 加之HPLC具灵敏度高、仪器普及面广、能一机多用等优势, HPLC法测定茶叶中的氨基酸正式进入广泛应用阶段[11-13], 但HPLC法的衍生化精确性及操作性等问题还有待更完善地解决[10, 12]。因此, 需寻求一种更准确、高效、快速、操作简便的方法来测定茶叶中的游离氨基酸。

液相色谱-质谱联用(LC-MS)结合了液相色谱的强大分离功能和质谱分析的高选择性、高特异性、高灵敏度、高稳定性; 样品处理简单, 分析通量高, 易于自动化; 分析复杂样品时干扰小, 数据准确度高, 可信度高, 特别适于低含量样品的检测分析。随着串联质谱(MS/MS)和电喷雾离子(ESI)源的快速发展, 使得LC-MS/MS法成为氨基酸检测的最热门分析手段之一。目前此方法在测定植物[14-17]、动物[18, 19]体内的游离氨基酸已见较多应用, 张磊等[20]应用气相色谱-质谱联用(GC-MS)与LC-MS分析筛选出茶氨酸、谷氨酸及其他与茶叶滋味密切相关的化学成分, 但还未见应用LC-MS/MS法测定茶叶中各游离氨基酸组分的研究报道。

本文通过对质谱、色谱条件和提取方法的优化, 在ESI源正离子扫描模式下检测, 建立了超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)直接测定茶叶中游离氨基酸的方法。采用该方法检测了黄化品种绿茶(九凝飞黄)、白茶(白牡丹)和红茶(英德红茶)中游离氨基酸组分的含量, 并与文献中茚三酮法和HPLC法的结果进行了对比和讨论。

1 实验部分
1.1 仪器及设备

UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司); ACE EXCEL 2U AQ色谱柱(150 mm×2.1 mm, 2 μm, 广州菲罗门公司); 分析天平(感量0.000 1 g, 瑞士Mettler Toledo公司); 超纯水系统(成都康宁实验专用纯水设备厂)。

1.2 试剂与材料

甲醇(色谱纯, 美国Tedia公司); 乙酸铵(色谱纯, 美国Fluka公司); 甲酸(色谱纯, 德国Merck公司)。氨基酸标准品:L-天门冬氨酸(L-aspartic acid, 简写为Asp, 纯度99%, 低金属含量)、L-脯氨酸(L-proline, 简写为Pro, 纯度99%)、L-缬氨酸(L-valine, 简写为Val, 纯度99%)、L-色氨酸(L-tryptophan, 简写为Trp, 纯度99%)、L-异亮氨酸(L-isoleucine, 简写为Ile, 纯度99%)、L-亮氨酸(L-leucine, 简写为Leu, 纯度99%)、L-半胱氨酸(L-cysteine, 简写为Cys, 纯度99%)、L-赖氨酸(L-lysine, 简写为Lys, 纯度98%)、L-酪氨酸(L-tyrosine, 简写为Tyr, 纯度99%)、L-谷氨酸(L-glutamic acid, 简写为Glu, 纯度99%)、L-丝氨酸(L-serine, 简写为Ser, 纯度99%)、L-苯丙氨酸(L-phenylalanine, 简写为Phe, 纯度99%)、L-蛋氨酸(L-methionine, 简写为Met, 99%)、甘氨酸(glycine, 简写为Gly, 纯度99.5%)、L-丙氨酸(L-alanine, 简写为Ala, 纯度99%)、L-天冬酰胺(L-asparagine, 简写为Asn, 纯度99%)、L-谷氨酰胺(L-glutamine, 简写为Gln, 纯度99%)、L-组氨酸(L-histidine, 简写为His, 纯度98%)、L-精氨酸(L-arginine, 简写为Arg, 纯度99%)、L-苏氨酸(L-threonine, 简写为Thr, 纯度99%)、L-茶氨酸(L-theanine, 简写为Thea, 纯度99%)均购自上海百灵威化学技术有限公司。水为超纯水。

选用九凝飞黄(浙江紫凝黄茶有限公司)、白牡丹(福建白天鹅茶业有限公司)和英德红茶(英德英茶辉达电子商务有限公司), 按照国标[21]制备成磨碎样品。

1.3 标准溶液的配制

氨基酸单体标准溶液配制:分别称取10.0 mg固体氨基酸单体标准物质, 分别用0.2%(体积分数, 下同)甲酸水溶液溶解, 配制成质量浓度为100 mg/L的标准溶液, 于4 ℃冰箱中避光保存。

氨基酸混合标准溶液配制:分别称取除Gly外的18种氨基酸及2种酰胺类标准品100.0 mg, 置于同一烧瓶, 用0.2%甲酸水溶液溶解, 配制成各氨基酸质量浓度为1 000 mg/L的混合标准溶液, 于4 ℃冰箱中避光保存。

1.4 氨基酸的提取条件
1.4.1 提取溶剂

称取5份试样, 每份取0.300 g, 置于三角锥形瓶中, 分别加入沸水、0.2%、0.4%、0.6%和1.0%甲酸水溶液各50 mL, 在沸水浴中浸提45 min。称取3份试样, 每份取0.300 g, 置于三角锥形瓶中, 分别加入0.2%甲酸水溶液、60%乙醇和85%乙醇各50 mL, 在75 ℃水浴中浸提45 min。称取1份试样, 每份取0.300 g, 置于三角锥形瓶中, 加入50 mL甲醇, 在60 ℃水浴中浸提45 min。分别过滤并定容, 过滤后的9份浸提液分别稀释200倍, 记为A1~A9;过滤后的9份浸提液分别稀释600倍, 记为B1~B9。将A1~A9和B1~B9分别用0.22 μm水相滤膜过滤, 测定。

1.4.2 提取茶水比

在1.4.1节的基础上, 选取最佳提取溶剂, 分别按茶水质量(g)体积(mL)比(简称茶水比)1:50、1:75、1:100、1:150、1:200的比例浸提45 min, 分别过滤并定容, 过滤后的浸提液分别稀释200和600倍, 再用0.22 μm水相滤膜过滤, 测定。

1.4.3 浸提时间

在1.4.1和1.4.2节的基础上, 选取最佳提取溶剂和茶水比, 分别提取10、20、30、45和60 min, 分别过滤并定容, 过滤后的浸提液分别稀释200倍和600倍, 再用0.22 μm水相滤膜过滤, 测定。

1.5 分析条件
1.5.1 UHPLC条件

经优化后确定的条件为:ACE EXCEL 2U AQ色谱柱(150 mm×2.1 mm, 2 μm); 流动相A为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.2%甲酸), 流动相B为甲醇; 流速:0.3 mL/min; 柱温:40 ℃; 进样量:5.0 μL。梯度洗脱条件:0~4.0 min, 100%A; 4.0~4.1 min, 100%A~100%B; 4.1~7.0 min, 100%B; 7.0~10.0 min, 100%B~100%A; 10.0~15.0 min, 100%A。

1.5.2 质谱条件

离子源为ESI, 正离子模式; 雾化气为氮气; 离子喷雾电压为3 500 V; 雾化室温度为120 ℃; 离子源温度为350 ℃; 碰撞气为氩气, 压强为0.2 Pa; 扫描模式为选择反应检测(SRM)。

2 结果与讨论
2.1 质谱条件优化

质谱条件的优化主要包括选择各氨基酸组分的子离子、去簇电压、碰撞能量等。稀释各氨基酸标准溶液至1 mg/L后, 用针泵进样的方式, 进质谱仪器直接分析, 通过母离子扫描, 调节碰撞能量, 获得稳定性好、信号强度高的碎片离子。共优化出除Gly之外的20种氨基酸参数, 结果见表 1。将氨基酸混合标准溶液进行检测, 得提取离子流色谱图(见图 1)。通过图 1可知, 20种氨基酸可以通过母离子、子离子和保留时间进行定性分析。

表 1 20种氨基酸质谱参数 Table 1 MS parameters for the 20 amino acids

图 1 20种游离氨基酸的提取离子流色谱图 Fig. 1 Extracted ion chromatogram of the 20 free amino acids
2.2 样品提取条件的优化
2.2.1 提取溶剂的优化

由于各氨基酸的R基不同, 各氨基酸在水中的溶解度不同, 如Arg易溶于水, 而Tyr几乎不溶于水。根据氨基酸溶于酸的特性及前人的提取研究情况[22]。选取沸水、不同浓度甲酸的水溶液、60%乙醇、85%乙醇和100%甲醇作为提取溶剂进行试验。根据各溶剂的沸点, 设定沸水浴、75 ℃水浴和65 ℃水浴。

表 2的结果可以看出, 用不同的溶剂提取氨基酸, 浸出氨基酸总量前3的溶剂顺序为:0.2%甲酸(75 ℃水浴)>0.2%甲酸(100 ℃水浴)>0.4%甲酸。添加甲酸的水溶液浸提率要略高于沸水浸提, 要明显高于乙醇和甲醇溶液, 浸出率最低的溶剂为100%甲醇, 多个氨基酸组分未检出。从表 2中也可以看出, 用0.2%甲酸(75 ℃水浴)浸提时, 主要氨基酸Thea、Arg、Asp浸出率也最高。因此, 提取溶剂选择0.2%甲酸(75 ℃水浴)。

表 2 不同提取溶剂提取的游离氨基酸含量 Table 2 Extraction contents of free amino acids by different extraction solvents
2.2.2 茶水比的优化

按5个不同比例的茶水比, 加入0.2%甲酸, 在75 ℃水浴中浸提45 min。由图 2可知, 茶水比对氨基酸提取影响也较为明显, 当茶水比增加时, 测得的氨基酸总量随之上升, 茶水比在1:100时, 氨基酸总量达到最高, 随后逐渐降低。Thea、Glu、Asp、Gln和Asn等主要氨基酸含量提取趋势与总氨基酸含量相同。经过分析, 确定提取茶水比为1:100。

图 2 不同茶水比对游离氨基酸总量和主要氨基酸含量的影响 Fig. 2 Effects of different tea-to-water ratios on the contents of total free amino acids and main amino acids
2.2.3 提取时间的优化

确定提取溶剂为0.2%甲酸(75 ℃水浴)和茶水比为1:100, 在此基础上, 将磨碎试样浸提10~60 min, 共设5个参数, 结果见图 3。提取10 min时, 氨基酸溶出率已较高, 氨基酸总量可溶出87.4%。在10~45 min期间, 总氨基酸含量随着提取时间增加而增加, 在45 min时达到最高, 随后降低。Thea变化趋势与氨基酸总量变化趋势基本一致, 在45 min时达到最高, 而Arg、Glu、Gln也在45 min时溶出率最高, 因此, 选择45 min为最终浸提时间。

图 3 不同提取时间对氨基酸总量和主要氨基酸含量的影响 Fig. 3 Effects of different extract times on contents of total free amino acids and main amino acids
2.3 方法评价
2.3.1 标准曲线、检出限和定量限

将7个不同质量浓度(1、10、50、100、250、500和1 000 μg/L)的混合氨基酸标准溶液分别进行检测, 用各氨基酸的峰面积对其相应的质量浓度(单位μg/L)进行回归分析, 以3倍信噪比为检出限(LOD), 以10倍信噪比为定量限(LOQ)。由于茶叶中各氨基酸含量差异很大, Thea和Arg含量非常高。因此在测定茶样时, 用稀释600倍后的提取液测定Thea和Arg, 稀释200倍后的提取液测定其他氨基酸。根据稀释后茶样中各氨基酸的含量范围, 确定20种氨基酸的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限。由表 3可知, 在茶叶中各氨基酸的含量范围内, 各氨基酸的响应值与浓度呈良好的线性关系, 其相关系数均可达0.99以上。LODs为0.001~0.011 mg/L, LOQs为0.010~0.053 mg/L。

表 3 氨基酸的线性范围、回归方程、相关系数(r2)、检出限和定量限 Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), LODs, and LOQs of the amino acid
2.3.2 方法准确度和精密度

采用标准加入法, 进行加标回收试验。分别称取0.50 g茶叶样品, 加入适量的氨基酸混合标准溶液, 根据各氨基酸定量限和茶叶中实际含有的各氨基酸浓度(Thea和Arg除外), 配制成20和10 mg/L的添加水平。按照2.2节优化的样品提取方法进行提取, 稀释200倍, 相当于最终检测样中混合标准溶液的质量浓度为100和50 μg/L。根据各氨基酸在茶样中的含量水平, 检测并计算各氨基酸的回收率(Thea和Arg除外), 结果见表 4。分别称取0.50 g茶叶样品, 加入适量的混合标准溶液, 配制成30 mg/L的添加水平, 按照2.2节优化的样品提取方法, 进行提取, 稀释600倍, 相当于最终检测样中混合标准溶液的浓度为50 μg/L, 检测并计算Thea和Arg的回收率, 结果见表 4。由表 4可知, 样品溶液中20种氨基酸的回收率为92.3%~109.2%, 方法具有较高的准确度。将10 μg/L的氨基酸混合标准溶液平行测定6次, 其结果见表 4, 可知RSDs为2.00%~9.88%, 方法具有较好的精密度。

表 4 游离氨基酸在茶叶样品中的添加回收率和相对标准偏差(n=6) Table 4 Spiked recoveries and RSDs of free amino acids in the tea sample (n=6)
2.4 实际样品检测

表 5所示, 采用上述方法检测黄化品种绿茶(九凝飞黄)、白茶(白牡丹)和红茶(英德红茶)中游离氨基酸组分的含量。数据显示, 在九凝飞黄中, Thea、Arg、Asp、Asn、Glu和Ser的含量要明显高于白牡丹和英德红茶, 白牡丹中主要氨基酸Thea、Arg、Asp、Ser等含量要明显高于英德红茶, 氨基酸总量为九凝飞黄>白牡丹>英德红茶。之前的研究[23, 24]表明, 白化或黄化茶树品种加工的茶叶与其他茶叶相比, 会具有较高的氨基酸含量。用茚三酮比色法[4]测定九凝飞黄氨基酸总量为6.26%, 除去两个酰胺类物质的含量, 此法检测的氨基酸总量略低于茚三酮比色法检测结果。用高效液相色谱(HPLC)法[25]检测九凝飞黄中的Thea, 测得含量为2.26%。由表 2可知, 用沸水提取时, 九凝飞黄中Thea的检测结果为2.240%, 接近HPLC法检测结果。当应用此法中优化后的提取条件进行检测时, 九凝飞黄中Thea含量为2.347%, 略高于上两者, 进一步验证了此法的准确性。

表 5 不同种类茶中游离氨基酸含量 Table 5 Contents of free amino acids in different types of tea
3 结论

本文通过对质谱、色谱条件和茶叶中氨基酸提取方法的优化, 建立了UPLC-MS/MS直接测定茶叶中游离氨基酸的方法。与氨基酸自动分析仪法和HPLC法相比, 该方法操作简单, 不需要对茶样进行衍生化处理, 分析时间短。该法具有较高的灵敏度和准确性, 具有良好的重复性和稳定性, 可有效检测出茶叶中的20种氨基酸, 可用于检测茶叶中的游离氨基酸组分。

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