Waters公司超高效液相色谱仪配置高灵敏度质谱仪组成了LC-MS/MS系统, 被广泛应用于临床诊断(IVD)、药物分析及有机化合物分析。部分使用单位发现在新生儿筛查系统、维生素D检测或其他血液/蛋白质类样本检测时, I-Class FTN进样器易发生压力高/堵塞现象, 影响正常使用。本文从原理入手, 根据故障排查流程图, 帮助使用者判断问题所在, 让实验人员自己动手解决部分问题。文中探讨了FTN进样器压力高/堵塞问题发生的部分原因, 供实验人员参考。
组成 二元溶剂管理器(BSM), 支持最高耐压18 000 psi(约为124 MPa, 1 MPa≈145 psi, 下文不一一换算); 样品管理器(SM-FTN), 不锈钢进样针, 温控4~40 ℃; 柱温控制器(Col HT):室温~90 ℃; 检测器:质谱检测器(与Xevo TQD组成LC-MS/MS或新生儿筛查系统)或二极管阵列(PDA)/紫外可见光(TUV)组成普通UPLC系统。
特点 由于使用超高压设计, 系统扩散极小(93 μ L), 使用ID=0.003" NP35不锈钢管, 故其系统压力较常规HPLC高。
色谱级乙腈; 超纯水; 100 mL烧杯; 1/2"、1/4"、16/5"双开口扳手; 2 mm内六角螺丝刀; T6、T10、T20梅花头螺丝刀; 一次性无粉手套一盒; 超声波清洗器一台。
I-Class控制台交互界图二元溶剂管理器(BSM)的功能包括流速控制、溶剂灌注和漏液压力检测; 控制台交互界图样品管理器(SM-FTN)的功能包括进样针密封测试、进样针高度校正、六通进样阀(简称:六通阀)流路压差检测和阀手动切换。
FTN进样器发生堵塞的地方常见有进样针(sample needle)、针座(needle seal)、针座到六通阀的回流管路(seal extension tube)及六通阀(injector), 可通过切换六通阀位置来快速隔离发生堵塞的地方。启动二元溶剂管理器流速, 确认针处于针座内, 进入到控制台FTN的交互界面, 手控切换六通阀的位置并记录压力, 如果进样(inject)位置(图 1a)比上样加载(load)位置(图 1b)压力高很多(常规:系统压力是69.0 MPa(10 000 psi), inject位置压力比load位置高2.8 MPa(400 psi)左右), 可以判断针、针座、针座回流管路及六通阀中的某些部位发生堵塞。(请参考ACQUITY UPLC I-Class IVD Sample Manager-Flow Through Needle Overview and Maintenance Guide 715003737IVD。Waters公司官网http://www.waters.com。)
先将六通阀上4#口的针螺丝拧开, 启动二元溶剂管理器, 设定0.5 mL/min 100%乙腈, 将FTN的门打开, 进入Acquity UPLC控制台, 点FTN模块的reset让FTN进行自检, 自检完后FTN会将针停在样品盘上方而非针座里面, 此时进入到FTN控制台的交互模式, 点控制, 手控, 将阀位置切换到进样(inject)状态, 此时如果压力很小(40 psi左右), 说明六通阀的4#-5#口没有发生堵塞; 此时再将针连到4#口, 如果压力仍然很小(40 psi左右)且肉眼能见液体顺利从针尖滴下, 说明针未发生堵塞, 如果压力高, 说明针已发生堵塞。
在Acquity UPLC控制台界面, 点Maintain＞Replace＞Needle。(1)开FTN门, 拧松锁定螺丝(见图 2a, 红圈位), 移除挡板; (2)松开六通阀的4#口针(见图 2b, 红圈位); (3)针锁定销(needle latch)逆时针转动(见图 2c, 左图黑色箭头), 将针从导管中移出; (4)松开卡位销(图 2d红箭头位), 将针取出(见图 2d及图 2e)。
高压冲洗:将针拆下, 移至FTN外面, 放入量筒或烧杯内, 针可重新连接4#口, 启动I-Class二元溶剂管理器, 流速可逐渐增大, 直到泵压上升至10 000~15 000 psi, 通常可将堵塞物冲出。换针:建议将原15 μ L进样针改换成30 μ L针, 针体积增大一倍, 针内径自然增大, 堵塞风险就会降低。
打开FTN的门, 在控制台上点FTN reset, 将针停留在样品盘上方而非针座; 将6#口螺丝拧开, 启动二元溶剂管理器, 设定0.5 mL/min 100%乙腈, 六通阀处于加载(load)位置, 如果压力低(40 psi左右), 说明5#-6#口没有发生堵塞; 将针座回流管路1#口螺丝拧到6#口, 如果压力低, 说明针座和针座回流管路通畅, 如果压力高则说明针座或/和针座回流管路堵。如果判断是针座或/和针座管回流路堵, 需要将FTN针座拆出, 再反冲针座回流管路, 如果压力较小, 说明针座回流管路畅通, 是针座堵, 如果压力仍然很高, 说明针座回流管路堵。
针座反冲处理:将FTN门打开, 在控制台中, 点FTN重设(reset), 让FTN完成自检, 使得针处于样品盘之上而非针座内, 将六通阀上的6#口管线拧开, 将针座回流管路1#口螺丝拧开接到6#口上, 启动二元溶剂管理器, 设定流速进行反冲, 建议先使用小流速(0.1 mL/min), 逐渐加大流速, 直到压力正常为止。
针座回流管路反冲:可按针座反冲步骤处理, 也可将针座取出后再反冲, 如反冲无效, 则需要更换针座管路。
拆针座:在I-Class控制台, 选择Maintain＞Replace＞Seal。(1)开FTN门, 将前挡板移除; (2)卸清洗台锁定螺丝; (3)取出清洗台并分离座组件(见图 3a); (4)取出针座(seal)(见图 3b)。
针座超声处理:将针座取出, 放入烧杯, 加入超纯水超声20 min, 弃去液体, 然后加入甲醇-水(90: 10, v/v)超声20 min, 取出针座, 安装好, 反冲, 如果仍然无法将压力降到正常水平, 则需要更换针座。
堵塞判断及反冲:先将六通阀上4#口及5#口的针螺丝拧开, 启动二元溶剂管理器, 设定0.5 mL/min 100%乙腈, 将FTN的门打开, 进入到FTN控制台的交互模式, 点控制, 手控, 将阀位置切换到进样(inject)状态, 此时如果压力很小(40 psi左右), 说明六通阀的4#-5#口间没有发生堵塞, 反之堵塞; 切换到上样(load)状态, 如果压力很小(40 psi左右)说明六通阀的5#-6#口间没有发生堵塞, 反之堵塞; 若堵塞, 可将5#口管路连接4#或6#口, 启动二元溶剂管理器, 设定流速由0.2 mL/min慢慢增大, 直至压力为15 000 psi, 反冲, 如果没冲通, 则按下列方法清洗六通阀。
清洗:进入FTN控制台, 在界面顶部选中Maintain, 下拉菜单选中Park needle and injector valve, 并点击, 使六通阀进样器处于初始可拆下位置, 用T10螺丝刀拧下10点钟位螺丝, 取下六通阀, 用T20螺丝刀分别拧下2点钟位、6点钟位及10点钟位螺丝, 分别取下定子(stator)(Waters独特设计定子与定子面组件集成一体化为不断流六通阀)及密封转子(rotor seal), 并将这2个部件放入烧杯, 纯水超声30 min, 对光目测检查这2个部件孔是否导通, 或将二元溶剂管理器出口管路直接连接到六通阀定子的每个入口, 高压冲洗检查, 直至定子端口全部导通。在确认定子端口全部正常、密封转子没被损坏后, 按原位组装回去, 此时切勿将密封转子面方向搞错, 密封转子位置是唯一的, 用手拧紧锁定定子的3颗螺丝, 然后用T20螺丝刀慢慢交替均衡加力锁紧, 确保其在18 000 psi压力下不渗液。
将堵塞针座拆下, 用放大镜观察, 在针座seal处发现有:(1)黑色黏稠的物质(胶), 见图 4; (2)发光亮的锡箔纸/铝箔纸; (3)杂质颗粒。
经与使用者沟通探讨, 分析故障源如下:
*黑色黏稠物质(胶)是用户使用不当导致96孔板覆盖膜或密封胶吸入所致。
*样品中的有机溶剂(例:甲醇)挥发溶解锡箔纸/铝箔纸上的胶, 使之回流到样品孔内。
*发光亮的锡箔纸/铝箔纸是用户使用劣质的锡箔纸/铝箔纸所致。FTN的进样针尖是平口的, 针尖吸样, 当针插入96孔板时, 密封板的锡箔纸/铝箔被快速刺穿时, 易产生碎片并沉入样品孔底部, 再被吸入针内, 注入针座(已有维修案例证实)。建议使用高品质的96孔样品盘覆盖膜, 覆盖膜应富有弹性、韧性且质地较厚。
*杂质颗粒疑似流动相没过滤、血液样品中的蛋白质凝固或是溶液中的盐析出。建议实验室采购高品质的有机试剂/水。
*环境中的灰尘有可能会被引入到样品中。需保证实验室环境清洁, 不开窗。
*过滤流动相的滤膜品质较差。建议实验室采购高品质过滤膜。
(1) 仪器和方法设定方面的原因:血样中的蛋白质等物质的沉淀, 吸样时被吸入到进样器内, 这主要是样品处理不到位, 进样浓度高所致。建议降低进样浓度, 提高针位置, 降低吸样速率和进样量, 避免吸入底部可能存在的沉淀物。96孔样品板(图 5a)与48孔托盘2 mL样品瓶(图 5b)缺省设定针尖与瓶底距离分别为2 mm与4 mm, 我们可设定96孔板此距离为4 mm, 将针上提2 mm。
(2) FTN洗针时, 无法清洗到插入到针座needle seal部位。该部位可能有少量残留的样品中的蛋白质, 随着进样次数增多, 逐渐堵塞针座。建议定时将针座超声清洗。
一般而言, Waters UPLC及LC-MS/MS新筛系统中所使用的I-Class FTN进样器压力高/堵塞是使用中的技术问题造成的; 我们分析了各种堵塞原因, 为实验人员提供了故障排查思路及自己动手解决方案。我们期待上述内容能帮助实验人员使用好现有的仪器, 充分发挥仪器的卓越性能, 保证测试数据准确可靠, 减少宕机时间及维修次数, 节省使用成本。
2018,
Vol. 36 Issue (5): 500-503
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