近年来,违法使用碱性橙、罗丹明B、孔雀石绿等工业碱性合成色素的食品安全问题尤为突出。这些工业碱性色素具有较强的致毒、致癌作用,由于色彩丰富、价格低廉、着色稳定,被某些不法分子非法添加在食品中,对人民健康和社会稳定造成危害,成为食品安全领域内的高危风险因子。因此,目前关于食品中碱性橙、罗丹明B、孔雀石绿等碱性色素的检测方法越来越受关注,已有较多报道[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]。
近几年有关色素的检测方法层出不穷,主要有分光光度法[8]、薄层色谱法[9]、毛细管电泳法[10]、示波极谱法[11]、酶联免疫吸附分析法[12]、高效液相色谱法[13, 14, 15, 16]、液相色谱-串联质谱法[17, 18]等,由于不同色素的极性不同,导致现有的检测方法在高灵敏度和高效方面具有一定的局限性。
四极杆飞行时间质谱(Q-TOF MS)能提供精确质量数,可通过分子质量数的匹配对化合物进行鉴定和确证,现在已开展了部分研究,如奶酪中色素的分析[19]、饮料中色素的快速检测[20]。但是目前使用Q-TOF MS对于食品中未知添加物的筛查研究总体上比较少,尤其是对水产品中的色素筛查未查到相关报道。因此,本文以水产品为研究对象,对其中15种禁用的碱性合成色素进行分析,并对样品前处理方法、液相色谱条件、质谱条件进行优化,以期建立水产品中多种色素的UPLC-Q-TOF MS快速高效的检测方法。
Agilent UHPLC和Agilent 6540-QTOF(Agilent公司,美国); Avanti®J-E高速冷冻离心机、Talboys涡旋混合器、N-EVAPTM-112氮吹仪、样品萃取管;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸为色谱纯,均购自上海安谱实验科技股份有限公司;无水硫酸镁、乙酸铵为分析纯;C18填料(40～63 μ m)、硅胶粉(40～63 μ m)均购自上海安谱实验科技股份有限公司;阳离子交换小柱(Oasis MCX)、弱阳离子交换小柱(Oasis WCX)均购自Waters公司;C18小柱购自上海安谱实验科技股份有限公司;实验用水为Milli-Q超纯水。
标准品:金胺(Auramine O,纯度89% )、隐性孔雀石绿(Leucomalachite Green,纯度90% )、孔雀石绿(Malachite Green,纯度89% )、苏丹红III(Sudan III,纯度91% )、苏丹红IV (Sudan IV,纯度91% )、苏丹黄(Butter Yellow,纯度89% )、苏丹黑B(Sudan Black B,纯度91% )、碱性橙II(Chrysoidine G,纯度89% )、罗丹明B(Rhodamine B,纯度91% )、苏丹橙(Sudan Orange G,纯度89% )、苏丹红7B (Sudan Red 7B,纯度91% )、苏丹红G(Sudan Red G,纯度91% )、苏丹红I(Sudan I,纯度91% )、苏丹红II(Sudan II,纯度91% )、橘红2号(Citrus Red 2,纯度91% ),均购于上海安谱实验科技股份有限公司。
分别准确称取15种碱性合成色素标准品各10 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解,配制成1 g/L 的单标准储备液(-20 ℃保存),再分别吸取1 g/L 的15种单标准储备液各1 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇定容得10 mg/L 的混合标准溶液。实验中使用初始流动相溶液将其稀释成相应的标准工作溶液,于4 ℃保存。
称取2.0 g样品于50 mL带盖聚四氟乙烯离心管中,加入10 mL乙腈(含有1%(v/v)乙酸)溶液,涡旋1 min,超声5 min,以 10 000 r/min 冷冻离心10 min,取5 mL上清液转移至基质分散管中,管内装有C18复合硅胶吸附剂(500 mg无水硫酸镁、100 mg C18粉末、40 mg硅胶粉末),振荡基质分散管5 min,以 10 000 r/min 冷冻离心10 min,取离心后的上清液3 mL,经氮气吹干,用甲醇-水(50 ∶ 50,v/v)溶解并定容到1 mL,过0.22 μ m有机滤膜后供UPLC-Q-TOF MS分析测定。
Agilent Eclipse Plus-C18(100 mm×3.0 mm,1.8 μ m)作为分析柱,柱温为30 ℃;流动相:A相为5 mmol/L 乙酸铵-0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为乙腈;梯度洗脱程序:0～1 min,5%B～20%B; 1～10 min,20%B～100%B; 10～15 min,100%B。进样体积为3 μ L,流速为0.2 mL/min。
离子源:电喷雾离子(ESI)源;扫描方式:正离子全扫描;全扫描范围:m/z 50～1 100;毛细管电压:4 000 V;离子源喷雾电压:250 V;离子化电压:130 V;鞘气温度:350 ℃;干燥气温度:325 ℃;鞘气流速:11 L/min;干燥气流速:8 L/min;数据采集模式:全息离子扫描(All ions MS/MS)。参比溶液中含三氟乙酸(C2HF3O2,其精确相对离子质量为 112.985 5)和六(1H,1H,3H-全氟丙氧基)磷氮的加氢离子(C18H19F24N3O6P+3,其精确相对离子质量为 922.009 8)。
数据采集与处理通过Agilent Mass Hunter Workstation Software (Version B.05.00)软件完成,碎片离子数据库建立通过Agilent Mass Hunter PCDL Manager (B.04.00)软件完成。
本文以隐性孔雀石绿、苏丹红III等为代表的15种在水产品中禁用的碱性合成色素为研究目标物进行检测,依据它们的相对分子质量和理化性质的差异,结合应用UPLC技术进行色谱分离,Q-TOF MS进行质谱信息采集。图1是15种碱性合成色素的分子特征提取色谱图,并由All ions MS/MS模式收集15种目标物的母离子及保留时间等信息(见表1)。通过实验获得的质谱信息并结合Agilent Mass Hunter软件对目标物进行质谱库对比,以保留时间、母离子和碎片离子精确质量数、同位素丰度模型进行比对确证,以母离子用于定量分析。由于方法中的碎片匹配采用了二级全离子图谱匹配,所以匹配度比一般用特征子离子的方式有更高的可靠性和准确度,效果更好,使得筛查的准确度更高。
提取溶剂的优化需同时考察目标化合物和样品基质的特性,合适的提取剂可有效分离目标物与基质杂质,从而增加对样品中目标物的检测灵敏度。本实验比较了4种有机溶剂——乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮,研究分析表明,乙腈最适合作为水产品中碱性合成色素的提取剂,回收率最高,达到90% 。乙腈适用范围广,它不仅减少了对基质中油脂的溶解,且可有效沉淀蛋白质,减少杂质对色素的干扰。二氯甲烷因溶剂密度大,提取液分布于底层,增加操作难度,回收率为82% ;此外,以丙酮和乙酸乙酯提取色素时,回收率偏低,均在60%以下。在确定了最优提取剂的基础上,本文进一步分析了加入1%(v/v)乙酸的乙腈溶液对色素的提取效率,结果显示加入乙酸后提取剂不仅保持了较好的回收率(达到96% ),且能使目标物离子化,为下一步提取液的分离净化处理奠定了良好基础。因此,本文确定最优提取溶剂是含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液。
本实验选用3种常用的固相萃取柱(C18柱、Oasis WCX柱、Oasis MCX柱)和C18复合硅胶基质萃取管对水产品中色素的提取分离效率进行比较分析,样品中色素的回收率结果见表2。由表2可知,以C18复合硅胶基质萃取管为净化载体时,样品中色素的回收率最高,分析原因可能有以下几个方面:①C18固相萃取小柱具有强疏水性,但吸附性较弱,导致15种碱性合成色素回收率较低(在60% ～75%之间); ②弱阳离子交换柱和阳离子固相萃取小柱平均色素回收率为85.13%和74.09% ,但对个别目标物如碱性橙II、苏丹红II等的吸附能力较弱,达不到检测方法要求的高通量检测要求;③从表2可以看出,自制C18复合硅胶混合基质萃取管对15种碱性合成色素的平均回收率高达96.58% ,它通过不同吸附剂对目标物进行针对性的保留,有效地去除杂质干扰,提高了碱性合成色素的净化效率,缩短了检测周期。同时对于萃取管中吸附剂的量进行了考察,结果发现:无水硫酸镁的量在500 mg及以上时处于过饱和状态,达到良好的盐析效果;当C18和硅胶的配比为100 mg ∶ 40 mg及以上时,对于回收率和净化效果不再有明显的促进效果,因此考虑到成本及效果,最终选择了吸附剂的使用量为500 mg无水硫酸镁、100 mg C18粉末、40 mg硅胶粉末。因此,本文确定使用C18复合硅胶基质萃取管作为净化载体,从而使15种碱性合成色素物质有较好的回收率,为水产品中色素的检测方法提供了一个快速有效的净化手段。
配制0.1～500 μg/L(0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg/L)的混合标准溶液,以分子离子峰面积(Y)对相应的质量浓度(X,μg/L)分别绘制15种碱性合成色素的标准曲线,并将10 μg/L 混合标准溶液平行测定6次,计算峰面积的相对标准偏差(RSD),结果见表3。从表3可知,15种碱性合成色素在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数(r)≥0.993;RSD≤6.49% ,说明仪器精密度良好。
本文中的检出限与定量限是根据3倍和10倍信噪比的要求进行测定和计算的。实际操作中,我们根据10.0 μ g/kg 的添加回收试验(苏丹红III和苏丹红IV的加标量分别为100.0 μ g/kg 和50.0 μ g/kg)中目标化合物检测到的色谱峰进行3倍信噪比的换算,最后确定为检出限(LOD,S/N=3),而该色谱峰经10倍信噪比换算得到的含量为定量限(LOQ,S/N=10),最终通过采用初始流动相来稀释,直到信噪比分别达到3和10时的含量,进行最终各目标物的检出限和定量限的验证。如表4所示,15种目标物的LOD在0.05～2.0 μ g/kg 之间(苏丹红III和苏丹红IV的检出限分别为50.0 μ g/kg 和25.0 μ g/kg),同时15种色素的定量限小于5.0 μ g/kg(苏丹红III和苏丹红IV的定量限分别为100.0 μ g/kg 和50.0 μ g/kg)。
在阴性的鲳鱼样品基质中添加10、50和200 μ g/kg 3种不同浓度水平的15种混合标准溶液(苏丹红III和苏丹红IV的添加浓度分别为100、500、20 000 μ g/kg),按1.3节方法进行预处理,采用UPLC-Q-TOF MS测定提取液中的目标化合物,且每个水平重复测定6次,计算平均回收率及RSD,结果见表4。由表4可知,在不同加标浓度范围内,15种碱性合成色素的回收率为80.60% ～107.37% ,RSD为3.33% ～6.69% 。由15种碱性合成色素的检出限、定量限和回收率的实验结果,可以看出本方法满足快速筛查水产品中15种碱性合成色素的需要。
选取市售22份水产品——白蟹、富贵虾、小黄鱼、大黄鱼、龙头鱼、黄姑鱼、梅童鱼、鮸鱼、玉秃、鲳鱼、带鱼、青占鱼、马鲛鱼、鳓鱼、鲭鱼、鱿鱼、乌贼、海带、海蜇、海地瓜、蛏子和文蛤作为方法验证样品基质,并做了添加回收质控样(鲳鱼样品，模拟水平200 μ g/kg),结果未发现阳性样品,质控样回收率均大于80% 。下一步将以水产制品为采集对象,扩大筛查范围和样品种类。
将添加回收质控样以UPLC-Q-TOF MS技术检测分析,得到总离子流图，对目标物进行相对分子质量及标准物质谱图数据库检索,结果可知15种碱性合成色素化合物的匹配度均较高,其匹配度在85%以上。结果表明,经过乙腈和乙酸混合液提取和C18复合硅胶基质萃取管净化,15种碱性合成色素能够被UPLC-Q-TOF MS有效筛查出来。
本文利用C18 复合硅胶基质萃取管提取净化,结合UPLC-Q-TOF MS技术,建立了水产品中15种碱性合成色素的快速检测方法。样品前处理优化了提取剂和萃取柱种类的选择,对水产品中不同性质的合成色素进行了有效提取分离;并利用了Q-TOF MS的精确质量数定性功能对不同种类的色素化合物进行筛查。与目前已报道的方法相比,前处理简便、快捷、高效,数据采集和数据库建立采用全息离子扫描的方式进行,所有二级碎片的精确质量和丰度都能用来匹配,适用于水产品中15种碱性合成色素的快速筛选。
2015, Vol. 33 Issue (10): 1097-1103
PDF (831 KB)
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