稻曲病是一种水稻真菌病害,由绿核菌属绿核菌Ustilaginodea virens (Cooke) Takahashi侵染水稻穗部引起,遍布世界各产稻区^{[1, 2, 3]}。近年来,稻曲病已由过去的零星分布转变成为水稻主要病害之一^[4],不仅严重危害谷粒生长,降低水稻的产量与品质,而且稻曲病菌所产生的稻曲病菌毒素对人畜也具有毒害作用^{[5, 6, 7]}。据报道,稻曲病菌毒素能够阻止细胞微管蛋白的聚合,干扰细胞骨架的形成,并可抑制细胞有丝分裂,导致动物内脏发生病变^{[8, 9]}。有研究表明,不同稻曲病菌毒素的毒理存在差异,因此,准确鉴定稻曲病菌毒素才能科学、客观地对稻曲病污染稻米质量安全做出评价,并开展相关风险评估工作。

目前已明确稻曲球中存在ustiloxin A、ustiloxin B、ustiloxin C、ustiloxin D和ustiloxin F 5种稻曲病菌毒素,但现有检测方法主要局限于ustiloxin A、ustiloxin B、ustiloxin D中的一种或两种毒素的研究^{[10, 11, 12, 13]},而关于多种稻曲病菌毒素的同步检测方法尚未见报道。主要原因是免疫标记法、高效液相色谱法及高效液相色谱-串联质谱法等传统检测分析方法都依赖标准样品进行定性定量分析,而稻曲病菌毒素的标准样品尚无商品化供应。Koiso等^{[14, 15]}采用多次柱层析方法自稻曲球中分离纯化出5种单一稻曲病菌毒素,但该方法过程复杂、费时费力,分离纯化效率低,限制了稻曲病菌毒素的深入研究。因此如何实现从组分复杂的样品中快速分离、鉴定出目标物,成为快速准确分析稻曲病菌毒素的主要技术难题。

本文在参考文献^{[9, 13, 15]}基础上,利用LTQ-Orbitrap高分辨质谱技术,结合质谱解析软件^{[16, 17, 18]},对稻曲球水提取液进行了直接质谱分析,鉴定分析出5种稻曲病菌毒素;基于样品基质的复杂性以及对目标物痕量分析的要求,本实验采用了PCX混合阳离子交换柱固相萃取净化方法,结合优化的色谱和质谱条件,成功地建立了高效液相色谱-高分辨质谱分离和鉴定5种稻曲病菌毒素的方法,并应用此方法对不同生长时期的稻曲球进行了毒素含量变化趋势分析。本方法简便、快速、灵敏度高、定性准确。

Survryor系列液相色谱仪(美国ThermoFisher公司)、LTQ-Orbitrap组合高分辨质谱仪(美国ThermoFisher公司)、高速匀浆机(德国IKA公司)、Primo R离心机(美国ThermoFisher公司)、Bond Elut Plexa PCX混合阳离子交换柱(60 mg/3 mL,美国Agilent公司)。

甲醇(色谱纯,Merck公司),甲酸(色谱纯)、二氯甲烷(农残级)(Tedia公司),氨水(含量25% ～28% ,杭州长征化学试剂有限公司);实验室用水为Milli-Q高纯水。

于中国水稻研究所水稻试验田剪取稻曲球样品,放于密封袋,并冷冻保存于-40 ℃冰箱中。

称取2.00 g待测稻曲球样品于50 mL离心管中,加入10 mL水,于高速匀浆机中以 17 500 r/min 的转速高速匀浆1 min,超声提取10 min；再加入等体积的二氯甲烷充分振摇,于 7 000 r/min 下离心15 min,使其分层；收集600 μ L上清液,加入350 μ L水和50 μ L甲酸,混匀,待净化。

将PCX混合阳离子交换柱用2 mL 5%(v/v)甲酸水溶液条件化,待液面到达柱吸附层表面时立即加入上述待净化液,依次用2 mL 5%(v/v)甲酸水溶液和5%(v/v)甲醇水溶液淋洗小柱,最后用2 mL 5%(v/v)氨水甲醇溶液洗脱;收集洗脱液于5 mL玻璃试管中,在50 ℃下氮气浓缩至近干,最后用0.1%(v/v)甲酸水溶液定容至1 mL,涡旋混匀,并经0.22 μ m水相滤膜过滤后上机待测。

色谱柱:Xselect HSS T3(150 mm×2.1 mm,3.5 μ m);柱温:20 ℃;进样量:5.0 μ L;流动相:A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为甲醇;流速:150 μ L/min;梯度洗脱程序:0～5.00 min,90%A; 5.00～20.00 min,90%A～20%A; 20.00～20.10 min,20%A～10%A; 20.10～25.00 min,10%A; 25.00～25.10 min,10%A～90%A; 25.10～35.00 min,90%A。

离子源:电喷雾离子(ESI)源;扫描模式:全扫描;扫描范围:m/z 200～1 000;质谱分辨率:100 000;裂解模式:碰撞诱导解离(CID);鞘气(N₂)压力:241.33 kPa;辅助气(N₂)压力:34.48 kPa;毛细管温度:350 ℃。

目前,已报道的稻曲病菌毒素有5种,分别是稻曲病毒素A、B、C、D、F,其结构式如图1所示。该类毒素属于环肽类化合物,具有共同骨架结构:一个13元环内含一个醚键、一个羧基以及多个亚氨基。共同骨架结构决定了其化学性质的相似性,也体现了毒素之间具有一定的关联性,从而有利于物质的鉴定分析^[15]。

图1

Fig. 1

图1 5种毒素的结构式 Fig. 1 Structures of the five ustiloxins

将采集的样品按1.3节方法处理后,参考文献^{[9, 12, 13, 15, 19]},对稻曲球提取液进行HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析,通过高分辨质谱的全扫描质谱图、母离子的准确质量数、同位素丰度比和二级裂解规律进行总结和分析。结果表明:5种毒素在正离子模式下形成[M+H]⁺离子峰,准分子离子峰和同位素丰度比与理论质量数和理论丰度比基本一致,二级质谱得到的离子碎片和文献基本吻合。

采用高分辨质谱全扫描模式对样品进行质谱采集,参考已发表的文献对稻曲球样品成分进行初步归类。表1列举了样品中稻曲病菌毒素的质谱信息,其中包括各稻曲病菌毒素的保留时间、高分辨母离子、准确相对分子质量等相应信息。可以看出,5种组分的准分子离子的实际测定质量数与其理论质量数基本一致,其质量误差绝对值在0.4×10^-6～0.9×10^-6(0.4～0.9 ppm)之间,在允许范围之内(＜5 ppm)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 5种毒素的HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析参数 Table 1 HPLC-LTQ/Orbitrap MS analysis parameters of the five ustiloxins Analyte Molecular formula Retention time/min Ionformation Theoretical m/z Measured m/z Mass accuracy/10-6 (ppm) Ustiloxin B C26H39N5O12S 11.44 [M+H]+ 646.2389 646.2394 -0.8 Ustiloxin F C21H30N4O8 12.14 [M+H]+ 467.2136 467.2140 -0.9 Ustiloxin A C28H43N5O12S 13.45 [M+H]+ 674.2702 674.2707 -0.7 Ustiloxin C C23H34N4O10S 13.75 [M+H]+ 559.2068 559.2073 -0.9 Ustiloxin D C23H34N4O8 14.14 [M+H]+ 495.2449 495.2451 -0.4

表1 5种毒素的HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析参数 Table 1 HPLC-LTQ/Orbitrap MS analysis parameters of the five ustiloxins

本文还考察了5种毒素实际测定的同位素丰度比值,并与依据同位素组成与分布软件^[20]查到的理论同位素丰度比值相比较,结果(表2)表明,(M+1)/M和(M+2)/M的相对丰度偏差均符合欧盟关于质谱分析质量控制和确证程序的要求^[21]。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 5种毒素的同位素相对丰度 Table 2 Relative abundances of the five ustiloxins Analyte Type Relative abundance/% Error/% Theoretical Measured Ustiloxin A (M+1)/M 34.1 31.6  2.5 (M+2)/M 12.5  9.2  3.3 Ustiloxin B (M+1)/M 28.1 26.7  1.4 (M+2)/M  8.2  7.0  1.2 Ustiloxin C (M+1)/M 24.9 25.1 -0.2 (M+2)/M  7.4  4.5  2.9 Ustiloxin D (M+1)/M 24.9 25.1 -0.2 (M+2)/M  3.0  2.2  0.8 Ustiloxin F (M+1)/M 22.7 23.6 -0.9 (M+2)/M  2.5  2.6 -0.1 The software parameters: calculation method,high resolution; minimum abundance,0.1% .

表2 5种毒素的同位素相对丰度 Table 2 Relative abundances of the five ustiloxins

为了进一步确认该5种组分是否为稻曲病菌毒
素,实验对其二级质谱行为进行了考察分析。对5种稻曲病菌毒素准分子离子[M+H]⁺进行二级质谱扫描,通过对碰撞能量、方式等条件的优化,确定了5种毒素[M+H]⁺的子离子,并与国内外已发表文献^{[13, 22, 23]}中的稻曲病菌毒素子离子进行比对。结果(见表3)发现除了尚未有研究报道的ustiloxin C外,其他4种毒素子离子分别与文献报道相对应。由碎片离子可以看出,ustiloxin C与其他4种毒素的断裂规律基本一致,结合共同化学结构,确证为ustiloxin C。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 5种毒素在CID裂解模式下质谱产生的碎片离子 Table 3 Ion information of the five ustiloxins acquired by mass spectrometry in collision induced dissociation (CID) mode Analyte Normalized collision energy/% Product ions (m/z) Reported ions (m/z) Ustiloxin A 30 656.25,599.24,507.09,355.20,312.16,209.13 209,187[13, 22] Ustiloxin B 25 600.55,547.92,476.33,296.12,187.11,181.10 187,181[22] Ustiloxin C 22 541.20,484.17,466.16,355.10,349.97,187.11 Ustiloxin D 20 477.23,357.21,312.16,309.14,291.12,192.07 477,357,291,192[13, 22, 23] Ustiloxin F 20 449.20,349.95,327.20,263.10,192.07,126.71 449,263,192[23]

表3 5种毒素在CID裂解模式下质谱产生的碎片离子 Table 3 Ion information of the five ustiloxins acquired by mass spectrometry in collision induced dissociation (CID) mode

应用质谱裂解理论并结合Mass Frontier质谱解析软件,模拟考察了5种稻曲病菌毒素在质谱中的裂解规律。发现模拟得到的碎片离子和利用CID-MS/MS技术得到的碎片离子(见图2)基本吻合。

图2

Fig. 2

图2 ustiloxin D的二级质谱图 Fig. 2 MS/MS spectrum of ustiloxin D

基于复杂样品基质对仪器检测的干扰,本研究结合5种待测目标物的分子结构特点,利用酸性条件下可带正电的特性,选用PCX混合阳离子交换柱固相萃取净化方法,分别考察了净化液及洗脱剂中酸碱含量对5种稻曲病菌毒素分离的影响。

以5%(v/v)氨水甲醇溶液为洗脱剂,考察了净化液中甲酸含量(0、1% 、5% 、10%和15% ,均为体积分数)对5种毒素净化的影响。如图3a所示,净化液中甲酸的含量对5种毒素的净化效果影响较大,其中以ustiloxin C和ustiloxin F最为敏感,酸度过高或过低其净化效果都不好;当甲酸含量为5%时,5种毒素的总体过柱回收率最好,为94.2% ～101.4% 。因此实验选择净化液中甲酸含量为5%(v/v) 。

图3

Fig. 3

图3 (a)净化液中甲酸含量和(b)洗脱剂中氨水含量对5种毒素净化效果的影响(n=3) Fig. 3 Effects of (a) formic acid content in the purificant and (b) ammonia hydroxide content in the eluent on the purification of the five ustiloxins (n=3)

在上述优化条件基础上,本文进一步考察了不同氨水含量(0、1% 、5% 、10%和15% ,均为体积分数)的洗脱剂对5种毒素净化效果的影响。如图3b所示,当氨水含量为0时,无目标物检出;当氨水含量≥1%时,5种毒素的过柱回收率均达到90%以上,几乎全部毒素被洗脱。综合考虑PCX小柱的个别差异、实际样品的复杂性以及实验稳定性,本文选择5%(v/v)氨水甲醇溶液为样品洗脱剂。

参考稻曲球生长规律,将稻曲球随颜色的变化分为早期(黄色)、中期(黄绿色)和晚期(墨绿色)3个时期,利用本文建立的方法对3个不同时期的稻曲球样品进行检测,研究分析5种毒素在稻曲球不同生长时期中的变化趋势。如图4所示,在不同时期稻曲球中均鉴定到含有一定量的5种稻曲病菌毒素;同一时期稻曲球中5种毒素的色谱峰面积均存在明显差异,峰面积以ustiloxin A最大,ustiloxin C最小,表明稻曲球中5种毒素的含量差异明显,且以ustiloxin A为主要成分,该结果与尹小乐等^[11]的研究结果一致;而在不同时期稻曲球中5种毒素含量大小均表现为中期＞晚期＞早期,其中以ustiloxin A和ustiloxin B差异最为明显。综上所述,稻曲球形成过程中均有稻曲病菌毒素的产生,并以ustiloxin A为主;而毒素发生高峰期为稻曲球生长中期,推测其原因可能是稻曲球中期病菌生长代谢旺盛,毒素(次生代谢产物)产量最高。

图4

Fig. 4

图4 不同时期稻曲球样品中5种毒素的响应峰面积(n=3) Fig. 4 Peak areas of the five ustiloxins in false smut balls at different periods (n=3)

图5为实际样品中5种稻曲病菌毒素的色谱图,从中可以看出,采用本文建立的方法可使5种稻曲病菌毒素均得到基线分离,且峰形良好,能满足稻曲病菌的鉴定分析要求。

图5

Fig. 5

图5 实际样品中5种毒素的色谱图 Fig. 5 Chromatograms of the five ustiloxins in a sample Peaks: 1. ustiloxin A; 2. ustiloxin B; 3. ustiloxin C; 4. ustiloxin D; 5. ustiloxin F.

本文采用HPLC-LTQ-Orbitrap MS成功地鉴定到ustiloxins A、B、C、D和F 5种稻曲病菌毒素,解决了在缺乏相应标准品情况下难以对其分析的难题。针对复杂的样品基质,实验优化了PCX小柱的净化条件,得到以含5%(v/v)甲酸为净化液和5%(v/v)氨水甲醇溶液为洗脱剂的实验条件。利用本文建立的方法对稻曲球样品进行了鉴定分析,结果表明,本方法简便、快速、灵敏度高、定性准确,适用于鉴定分析稻曲病菌毒素,并可为稻曲病菌毒素的后续相关研究提供高效、可靠的技术手段。