多环芳烃因具有“致癌性、致畸性、致突变性”,已被世界多数国家或地区限制使用。德国政府早在2008年4月1日起就规定,要获取德国安全认证(GS认证)标志,必须通过《GS认证过程中PAHs的测试和验证》^[1]。该文件规定消费产品的材料中18种多环芳烃必须符合其规定的限量要求。欧盟官方公报于2013年12月7日刊登欧洲委员会第1272/2013号法规^[2],对玩具及儿童用品等轻纺消费品的橡胶或塑胶部件中含有的8种多环芳烃采取限制措施。美国环保局(US EPA)已经将16种多环芳烃列入优先控制的有机污染物名单中^[3]。上述涉及的18种多环芳烃分别为萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、 屈 艹 、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(j)荧蒽、苯并(e)芘、苯并(a)芘、茚并(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,h)蒽、苯并(g,h,i)苝(二萘嵌苯)。

目前,国内外轻纺消费品中多环芳烃的仪器分析方法主要为气相色谱法^{[1, 4, 5, 6, 7]}和液相色谱法^{[4, 5, 6]}。但是,目前气相色谱法在分离多环芳烃同分异构体(苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽和苯并(j)荧蒽)方面仍面临挑战^{[8, 9]}。液相色谱法对同分异构体选择性好,分离效率高,但是对于弱极性的多环芳烃保留时间较长,其分离18种多环芳烃所需的时间通常在30 min以上^[10]。

近年来发展的超高效合相色谱(UPC²)以液体和超临界气体的混合物——压缩CO₂为流动相,由于压缩CO₂不仅是低极性分析物的良好溶剂,也可促进分析物与流动相之间的非极性相互作用,因此超高效合相色谱技术适于分离非极性的多环芳烃化合物。超高效合相色谱以超临界流体为流动相,既可以分析气相色谱难以气化的高沸点、低挥发性样品,又具有比高效液相色谱更高的选择性和更快的分析速度^[11]。由于其所使用的色谱柱的填料粒径小于常规的超临界色谱柱填料粒径,其分离效率和分离度优于常规超临界色谱,同时流动相以无毒的CO₂为主,节约了有机溶剂。因此,超高效合相色谱方法引起研究者的广泛关注,其已成功应用于二甲基苯胺异构体^[12]、脂肪酸^[13]、荧光增白剂^[14]、脂溶性维生素及其衍生物^[15]和光引发剂^[16]的分析。目前,尚未见利用超高效合相色谱检测上述18种多环芳烃的报道。

本文建立一种以甲苯为提取溶剂,超声辅助萃取为提取条件,采用CO₂超高效合相色谱-二极管阵列检测器快速、准确测定塑料中上述18种多环芳烃的方法。该方法快速、高效、减少有机溶剂的消耗,为塑料制品中多环芳烃的检测提供了有力的技术手段。

超高效合相色谱仪(ACQUITY Ultra Performance Convengence Chromatograph^TM,美国Waters公司),配备二极管阵列检测器;T890/H超声波清洗机(德国Elma公司)。

甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、甲苯(色谱纯,美国Fisher公司)。高纯CO₂(纯度99.99% ,上海振信盖斯气体有限公司)。萘(纯度99.8% )、苊烯(纯度99.2% )、苊(纯度100.0% )、芴(纯度98.1% )、菲(纯度99.5% )、蒽(纯度97.7% )、荧蒽(纯度97.2% )、芘(纯度97.5% )、苯并(a)蒽(纯度100.0% )、 屈 艹 (纯度99.8% )、苯并(b)荧蒽(纯度99.4% )、苯并(k)荧蒽(纯度100.0% )、苯并(j)荧蒽(纯度98.3% )、苯并(e)芘(纯度99.5% )、苯并(a)芘(纯度99.8% )、茚并(1,2,3-cd)芘(纯度99.2% )、二苯并(a,h)蒽(纯度100.0% )、苯并(g,h,i)苝(二萘嵌苯)(纯度98.3% )均购于美国Accustandard 公司。

准确称取18种多环芳烃标准品各5.00 mg(精确至0.01 mg)于50 mL容量瓶中,用甲苯溶解并定容,得到质量浓度为100 mg/L 的标准储备液,准确移取一定量上述标准储备液,以甲苯稀释,得到系列浓度的混合标准溶液。

色谱柱:Daicel IB-3(150 mm×4.6 mm,3 μ m);流动相A为CO₂,流动相B(助溶剂)为甲醇/乙腈(25 ∶ 75,v/v)。流动相梯度洗脱程序:0～1 min保持5%B;经2 min升至25%B;再经2 min升至35%B,保持3 min;最后经0.2 min降至5%B。流速:2.8 mL/min;柱温:40 ℃;背压:15.17 MPa；样品进样量:5 μ L。PDA检测波长:2D(2-dimension)为220、240、260 nm,3D为200～500 nm。

样品前处理过程参见文献^[1],首先将塑料样品切割至尺寸不超过3 mm×3 mm的颗粒,液氮冷却粉碎。准确称取 0.500 0 g待测样品,置于玻璃锥形瓶中,加入20 mL甲苯萃取剂,60 ℃下超声萃取1 h,萃取液浓缩至1 mL,供UPC²-PDA分析。

由于待分析的18种多环芳烃化合物为非极性化合物,其与键合相之间的作用力主要是 π - π 、疏水作用力等,本研究选择下述4种非极性或含有苯环的键合相:BEH 2-EP(乙基吡啶),CSH Fluoro-phenyl(氟苯基),HSS C18 SB(Selectivity for bases,针对碱性化合物),Daicel IB-3(纤维素3-(3,5-二甲基苯甲酰胺)),在柱温为40 ℃,流动相分别为CO₂-甲醇、CO₂-甲醇/乙腈(1 ∶ 1,v/v)(梯度洗脱：5%B起始,3 min升至35%B,35%B保持2 min)的条件下进行色谱柱的选择与优化。每种色谱柱上获得的较好分离效果如图1所示,通过色谱柱的初步筛选发现,BEH 2-EP和CSH Fluoro-phenyl柱具有较好的分离效果,峰形尖锐,对称性良好,均能分离出17个化合物峰,但是个别化合物没能达到很好的分离;Daicel IB-3色谱柱具有最佳的分离效果,18种多环芳烃均能得到很好的分离,但是峰形与其他3种色谱柱相比较差;主要是不同的填料粒径所导致的(Daicel IB-3的填料粒径是3 μ m,其他3种色谱柱粒径是1.7 μ m)。综合考虑分离效果和峰容量等因素,最终选择Daicel IB-3色谱柱进一步优化。

图1

Fig. 1

图1 不同色谱柱对18种PAHs分离的色谱图 Fig. 1 Chromatograms of the PAH standards on various chromatographic columns Columns: a. Daicel IB-3; b. CSH Fluoro-phenyl; c. HSS C18 SB; d. BEH 2-EP column. Mobile phases: a. CO2-methanol; b. CO2-methanol/acetonitrile (1 ∶ 1,v/v); c. CO2-methanol; d. CO2-methanol.

超高效合相色谱的保留机理比较复杂,与LC对比,其保留行为类似正相色谱,因此流动相的极性改变会对待分析物的保留产生主要的影响。在UPC²的操作中,通常采用二元梯度/等度洗脱,一路溶剂是CO₂,另一路是单一或混合的有机溶剂,其中,常用的有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈。基于醇类溶剂和乙腈是两种不同类型的溶剂(如甲醇为质子给予型溶剂,乙腈为质子接受型溶剂),试验过程中选择甲醇和乙腈进行了优化。在色谱柱为Daicel IB-3(150 mm×4.6 mm,3 μ m),柱温为40 ℃,流速为2.2 mL/min(梯度洗脱：10%B起始,3 min升至35%B,35%B保持6 min)的条件下,不同甲醇/乙腈比例(100 ∶ 0、25 ∶ 75、50 ∶ 50,v/v)的分离图谱如图2所示。选用纯的甲醇溶剂作为助溶剂时,部分多环芳烃化合物不能很好地分离;当在甲醇中加入一定比例的乙腈后,不同多环芳烃的分离度有很大的改善,当乙腈比例从25%增加到50%时,18种多环芳烃的分离时间从8 min增加到8.5 min。综合考虑分离效率和分离时间,最终选择甲醇/乙腈的体积比为25 ∶ 75。

图2

Fig. 2

图2 不同流动相助溶剂条件下18种PAHs分离的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the PAH standards with different mobile-phase additives

对于超高效合相色谱而言,色谱柱温度的变化主要影响到流动相的密度,在保持其他试验条件不变的情况下,流动相的密度随温度的升高而降低,随温度的降低而升高。因此,一般情况下,分析物的保留会随着温度的升高而增强,随着温度的降低而减弱。同时,由于温度的改变,除密度之外的其他性能也会有一定的改变,如流动相的扩散系数、黏度、介电常数等,因此对不同分析物会产生不同的影响,试验过程中,常常以此作为分析物保留行为和选择性的微调参数。本试验中,在色谱柱为(150 mm×4.6 mm,3 μ m),助溶剂为甲醇/乙腈(25 ∶ 75,v/v),流速为2.2 mL/min(梯度洗脱：10%B起始,3 min升至35%B,35%B保持6 min)的条件下,综合考虑分离和色谱柱耐受性的因素,选择30 ℃和40 ℃进行对比。如图3所示,40 ℃下每个化合物之间的分离度均达到1.5以上,即基线分离,因此,实验最终选择柱温为40 ℃。

图3

Fig. 3

图3 不同色谱柱温度条件下18种PAHs分离的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of the PAH standards at different column temperatures

系统背压的改变会影响流动相的密度和黏度,通常的试验条件下,随着背压的升高,流动相的密度增大,其洗脱能力相应增强,对应化合物的保留减弱;反之,随着背压的降低,流动相的密度减小,其洗脱能力减弱,对应化合物的保留增强。在色谱柱为(150 mm×4.6 mm,3 μ m),柱温为40 ℃,助溶剂为甲醇/乙腈(25 ∶ 75,v/v),流速为2.2 mL/min(梯度洗脱：10%B起始,3 min升至35%B,35%B保持6 min)的条件下,考察了不同背压(12.41、15.17和17.93 MPa)对色谱分离的影响。如图4所示,当背压从12.41 MPa升高至17.93 MPa时,苯并(a)芘和二苯并(a,h)蒽的分离度明显降低,18种多环芳烃的分离时间从8.2 min降低至7.8 min。综合考虑分离效率和分离时间,最终选择15.17 MPa的试验条件。

图4

Fig. 4

图4 不同背压条件下18种PAHs分离的色谱图 Fig. 4 Chromatograms of the PAH standards at different back pressures

在优化的条件下,18种多环芳烃标准品的色谱分离结果见图5,各种多环芳烃的保留时间见表1。采用超高效合相色谱的方法,18种多环芳烃实现较好分离,其中包括气相色谱方法难以分离的同分异构体苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽和苯并(j)荧蒽,同时,把分离时间由常规方法的30～40 min降低至8.5 min^{[8, 9]}。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 18种PAHs的保留时间、标准曲线方程、相关系数、LOQ和检测波长 Table 1 Retention times,standard curve equations,correlation coefficients (r),LOQs and detection wavelengths of the 18 PAHs No. Compound Retention time/min Standard curve equation r LOQ/(mg/L) Detection wavelength/nm 1 naphthalene 1.35 Y=0.5567X+21.147 0.9998 0.05 220 2 acenaphthene 1.85 Y=1.1535X-6.732 0.9999 0.05 220 3 acenaphthylene 2.02 Y=0.2674X+1.113 0.9997 0.05 220 4 fluorene 2.39 Y=0.3004X+2.717 0.9996 0.05 260 5 phenanthrene 2.84 Y=0.4389X-1.405 0.9998 0.05 240 6 anthracene 3.46 Y=1.6491X-1.125 0.9998 0.05 240 7 pyrene 3.60 Y=0.7025X+0.005 0.9999 0.05 240 8 fluoranthene 3.88 Y=0.3580X+3.170 0.9997 0.05 240 9 chrysene 4.12 Y=0.9435X-5.881 0.9998 0.05 260 10 benzo(a)anthracene 4.32 Y=0.3558X-0.729 0.9997 0.05 260 11 benzo(b)fluoranthene 4.63 Y=0.2306X+1.5447 0.9999 0.05 240 12 benzo(k)fluoranthene 4.80 Y=0.3927X-0.2466 0.9996 0.05 240 13 benzo(j)fluoranthene 5.11 Y=0.2692X+0.4765 0.9999 0.05 240 14 benzo(a)pyrene 5.71 Y=0.3275X+0.4718 0.9996 0.05 260 15 dibenzo(a,h)anthracene 5.82 Y=0.2277X+4.8968 0.9996 0.05 220 16 benzo(g,h,i)perylene 6.08 Y=0.2680X+1.7460 0.9997 0.05 220 17 indeno(1,2,3-cd)pyrene 6.35 Y=0.2872X+1.4789 0.9997 0.05 240 18 benzo(e)pyrene 7.88 Y=0.1997X+2.0895 0.9995 0.05 220 Y: peak area; X: mass concentration,mg/L; linear range: 0.05-50 mg/L.

表1 18种PAHs的保留时间、标准曲线方程、相关系数、LOQ和检测波长 Table 1 Retention times,standard curve equations,correlation coefficients (r),LOQs and detection wavelengths of the 18 PAHs

在超高效合相色谱中,样品溶剂对分离的效果有较大的影响,即LC中常见的溶剂效应。尤其当流动相中的有机相比例较低时,样品溶剂会对化合物的保留和峰形产生较大的影响。基于超高效合相色谱类似正相HPLC的原理,一般情况下选择非极性的溶剂作为样品的溶剂,可以很好地避免溶剂效应的问题。如图5所示,甲苯在上述优化的分离条件下的保留时间为0.78 min,小于18种多环芳烃的保留时间,不会对样品分离产生干扰。结合本试验前处理的条件,选择甲苯作为样品溶剂,可避免溶剂效应的影响,样品前处理后可直接进样分析。

图5

Fig. 5

图5 多环芳烃混合标准溶液的色谱图 Fig. 5 Chromatogram of a mixture of the PAHs standards Column: Daicel IB-3 column (150 mm×4.6 mm,3 μ m); mobile-phase additive: methanol/acetonitrile (25 ∶ 75,v/v); column temperature: 40 ℃; back pressure: 15.17 MPa. Peak Nos. are shown in Table 1.

配制不同质量浓度的18种多环芳烃的混合标准工作液,在最优的试验条件下进行测定。将信噪比大于10时的质量浓度作为该化合物的定量限(LOQ),18种多环芳烃在各自的特征检测波长下的LOQ为0.05 mg/L。采用外标法定量,得到化合物的峰面积(纵坐标)和质量浓度(横坐标)的线性关系(见表1),18种多环芳烃的线性范围在0.05～50 mg/L 之间,线性相关系数均大于 0.999 5,表明线性关系良好。空白样品在3个浓度水平(0.1、0.2、0.5 mg/L)下的加标回收率范围为78.3% ～117.6% ,相对标准偏差(RSD,n=5)小于5% ,能够满足要求^[1]。

在上述优化的色谱条件下测定了充气玩具的塑料、拼装积木的蓝塑料、电动童车轮胎的黑橡胶中的多环芳烃。根据1.4节的方法对其进行提取后上机测定。根据标准品的保留时间进行定性,各组分的峰面积外标法进行定量。充气玩具的塑料、拼装积木的蓝塑料和电动童车轮胎的黑橡胶中多环芳烃含量及加标回收率见表2。加标回收率范围为70.4% ～118.4%(n=5)。该UPC²测定结果与GC-MS标准方法^[1]的测定结果相比,两个测定值的绝对差值在其算术平均值的20%以内。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 UPC2和GC-MS测定充气玩具的塑料、拼装积木的蓝塑料、电动童车轮胎的黑橡胶中多环芳烃的含量及UPC2方法的加标回收率 Table 2 PAHs in plastic (inflatable toy),blue plastic (block) and black rubber (tire) determined by UPC2 and GC-MS,and the spiked recoveries of UPC2 No Sample Compound Contents/(mg/kg) Spiked level/ (mg/L) Recovery/ % UPC2 GC-MS 1 plastic (inflatable toy) naphthalene 0.80 0.89 0.50 71.3 fluorene 0.22 0.19 0.20 70.4 phenanthrene 0.23 0.26 0.20 112.6 2 blue plastic (block) naphthalene 0.36 0.32 0.20 72.8 fluorene 0.39 0.42 0.50 118.4 phenanthrene 1.90 1.97 1.00 85.6 pyrene 0.22 0.19 0.20 108.3 fluoranthene 0.18 0.15 0.20 76.5 3 black rubber (tire) naphthalene 0.60 0.55 0.50 73.0 phenanthrene 1.66 1.80 1.00 89.6 pyrene 8.52 8.82 1.00 78.5 fluoranthene 2.30 2.45 1.00 112.5

表2 UPC2和GC-MS测定充气玩具的塑料、拼装积木的蓝塑料、电动童车轮胎的黑橡胶中多环芳烃的含量及UPC2方法的加标回收率 Table 2 PAHs in plastic (inflatable toy),blue plastic (block) and black rubber (tire) determined by UPC2 and GC-MS,and the spiked recoveries of UPC2

本文建立了一种采用超高效合相色谱快速、高效分析塑料制品中18种多环芳烃的方法。在优化条件下,18种多环芳烃实现较好分离,其中包括气相色谱方法难以分离的苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽和苯并(j)荧蒽同分异构体。同时,把分离时间由常规的30～40 min降低至8.5 min。该方法分析速度快,分离效率高,环境友好,准确度和灵敏度都能满足实际样品中多环芳烃分析的要求,能够为国内外市场上塑料制品中多环芳烃的分析提供有效的参考方法。