溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)^[1]和氟苯虫酰胺(flubendiamide)^{[2, 3]}为双酰胺类杀虫剂,对几乎所有的鳞翅目类害虫均具有很好的活性,不仅对成虫和幼虫都有优良的活性,而且作用速度快、持效期长;氟吡菌胺(fluopicolide)^[4]和双炔酰菌胺(mandipropamid)^{[5, 6]}属于酰胺类卵菌纲杀菌剂,主要防治霜霉病、晚疫病和腐霉类病害;啶酰菌胺(boscalid)^[7]为新型烟酰胺类内吸性杀菌剂,对防治灰霉病、菌核病和各种腐烂病等病害非常有效,并且对其他药剂无交互抗性,主要用于包括蔬菜、果树和大田作物等病害的防治;噻呋酰胺(thifluzamide)^[8]属于噻唑酰胺类杀菌剂,具有强内吸传导性和长持效性,对担子菌纲真菌引起的病害如纹枯病、立枯病等有特效,这6种酰胺类农药均具有极好的应用前景。国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission,CAC)、欧盟(European Union,EU)和日本等均制定了这6种农药在蔬菜和水果上的农药最大残留限量(maximum residue limit,MRL)^{[9, 10, 11]},而我国现行的GB 2763-2014中仅规定了啶酰菌胺在黄瓜和苹果等3种水果上的MRL、双炔酰菌胺在10种蔬菜和4种水果上的临时MRL、氟吡菌胺在西瓜和5种蔬菜上的临时MRL。同时,现行的GB/T 27069-2008中仅涵盖了啶酰菌胺的检测方法。因此,建立快速、准确的多残留分析方法尤为迫切和必要。目前,已报道的针对该类农药的检测方法有气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)检测法^{[12, 13]}、液相色谱法^{[14, 15, 16]}和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)^{[17, 18, 19, 20]},但气相色谱和液相色谱法检测易受杂质干扰,且检测时间较长。液相色谱-串联质谱法具有高效分离、高灵敏度、多组分定性与定量检测于一体等优点,已成为近年来农药多残留检测技术的主流方向,如段婷婷等^[17]建立了QuEChERS净化LC-MS/MS检测精米、玉米和土豆中的噻呋酰胺残留量;陈小龙等^[18]采用Florisil固相萃取柱净化,LC-MS/MS检测果蔬中啶酰菌胺和双炔酰菌胺的残留量;Rajski等^[19]采用New Z-Sep+净化管净化高油植物样品LC-MS/MS法检测其中双炔酰菌胺的残留量;钱程等^[20]采用QuEChERS法净化,Acquity UPLC BEH C18色谱柱分离,MS/MS检测了豇豆中溴氰虫酰胺的残留量。本研究采用SPE-UPLC-MS/MS方法,同时测定了蔬菜水果中6种酰胺类农药的残留量,方法具有操作简单、快速、易操作的特点,灵敏度、准确度完全能满足果蔬中农残检测的要求。

1290超高效液相色谱(美国Agilent公司); G6460三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司); Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司); T₁₈ ULTRA-TURRAX高速匀浆机(德国IKA集团)。

乙腈、甲醇(色谱纯,德国Merck公司);农药标准品(农业部环境保护科研监测所); PSA固相萃取柱(500 mg/6 mL)、NH₂固相萃取柱(500 mg/6 mL)、Florisil固相萃取柱(1 000 mg/6 mL)(天津艾杰尔公司);蔬菜和水果(番茄、豇豆、杭白菜、甘蓝、黄瓜、生菜、西瓜、桃、苹果、柑橘、葡萄,购于当地农贸市场)。

准确称取适量标准物质,用甲醇稀释成 1 000 mg/L 的标准储备液,-20 ℃保存,有效期一年。

根据每种农药在仪器上的响应灵敏度,确定其在混合标准溶液中的浓度,见表1。根据每种农药在混合标准溶液中的浓度,准确移取一定体积的单个农药的标准储备液于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 6种农药的混合标准溶液浓度和质谱采集参数 Table 1 Concentrations and optimized MS/MS parameters of the six pesticides Pesticide Retention time/min Precursor ion (m/z) Quantitative ion pair (m/z) Qualitative ion pair (m/z) Fragmentor/ V Collision energy/V Mixed concentration/(mg/L) Cyantraniliprole 4.95 470.9 [M-H]- 470.9/202.0 470.9/145.0 120 15/15 1.0 Mandipropamid 5.78 412.1 [M+H]+ 412.1/328.0 412.1/125.0 115 15/25 1.0 Boscalid 5.98 343.0 [M+H]+ 343.0/307.0 343.0/271.0 160 12/28 1.0 Fluopicolide 6.07 382.9 [M+H]+ 382.9/172.9 382.9/364.8 120 25/15 1.0 Thifluzamide 6.64 524.8 [M-H]- 524.8/125.0 524.8/166.0 130 35/25 1.0 Flubendiamide 6.79 681.0 [M-H]- 681.0/254.0 681.0/272.0 155 25/30 0.1

表1 6种农药的混合标准溶液浓度和质谱采集参数 Table 1 Concentrations and optimized MS/MS parameters of the six pesticides

ESI源正/负双离子模式电离;多反应监测(MRM);鞘气温度:350 ℃;鞘气流量:12 L/min;雾化气压力:0.28 MPa;毛细管电压:3 000 V(ESI⁺),3 500 V(ESI^-);干燥气温度:300 ℃;干燥气流量:7 L/min;质谱采集参数见表1。

色谱柱为Agilent Proshell 120 EC-C18柱(100 mm×3.0 mm,2.7 μ m);流动相为0.1%甲酸水溶液(A相)和甲醇(B相)。柱温:30 ℃;进样量:2 μ L;流速:0.3～0.4 mL/min;梯度洗脱程序:0～2 min,流动相B由10%升至20% ,流速0.4 mL/min; 2～3 min,流动相B由20%升至70% ,流速保持0.4 mL/min; 3～4 min,流动相B由70%升至75% ,流速保持0.4 mL/min; 4～5 min,流动相B由75%升至80% ,流速保持0.4 mL/min; 5～5.5 min,流动相B由80%升至85% ,流速保持0.4 mL/min; 5.5～6 min,流动相B由85%升至90% ,同时流速降至0.3 mL/min; 6.0～6.5 min,流动相B由90%升至95% ,同时流速保持0.3 mL/min; 6.5～11 min,流动相B保持95% ,流速恢复至0.4 mL/min。分析时间为11 min;后运行时间为3 min。外标法定量。

准确称取20 g(精确至0.1 g)样品至250 mL三角瓶中,加入40 mL乙腈,在高速匀浆机中匀浆1 min,收集滤液至装有5～7 g NaCl的200 mL具塞量筒中,盖上盖子后,剧烈振荡1 min,室温下静置1 h。取上清液10 mL,于40 ℃水浴条件下用氮气吹至近干,残渣用2 mL二氯甲烷-甲醇(95 ∶ 5,v/v)溶解,待净化。

Florisil固相萃取柱用5 mL二氯甲烷-甲醇(95 ∶ 5,v/v)活化,将样品转移至固相萃取柱中,再用二氯甲烷-甲醇(95 ∶ 5,v/v)洗涤样品瓶,每次4 mL,洗涤2次,并将洗涤液全部转入固相萃取柱中,收集全部流出液。将其在40 ℃水浴条件下用氮气吹至近干后,用5 mL甲醇复溶,并过0.22 μ m有机相滤膜,待检测。

参照1.4节方法进行样品预处理,制备空白基质溶液。分别用纯溶剂和空白基质溶液配制农药浓度相同的两种检测液,在完全相同的色谱条件下检测,根据两种检测液的色谱响应值按式(1)计算该水果、蔬菜基质溶液的基质效应^[21]。

以甲醇-水(50 ∶ 50,v/v)为流动相,在电喷雾正离子模式下,分别对1.0 mg/L 的单个标准溶液进行一级质谱扫描,溴氰虫酰胺和氟吡菌胺准分子离子峰只能得到[M+H]⁺一种形式,双炔酰菌胺、噻呋酰胺和啶酰菌胺能得到[M+H]⁺和[M+Na]⁺两种形式的准分子离子峰,而氟苯虫酰胺则能得到[M+Na]⁺和[M+K]⁺两种形式的准分子离子峰。通过子离子扫描发现,双炔酰菌胺、噻呋酰胺和啶酰菌胺[M+Na]⁺无法产生稳定的子离子,而氟苯虫酰胺[M+K]⁺的准分子离子峰则无法通过碰撞产生子离子。此外,研究发现电喷雾正离子模式下,溴氰虫酰胺、氟苯虫酰胺和噻呋酰胺的灵敏度极低;采用电喷雾负离子模式,通过优化质谱参数,这3种农药的灵敏度分别有10、30和300倍的增长。结合基质空白和基质标准液的离子扫描图,进一步优化参数,确定了6种农药在MRM模式下的质谱采集参数及质谱条件,见表1。图1为UPLC-MS/MS分析6种酰胺类农药的定量离子的提取离子色谱图(EIC)。

图1

Fig. 1

图1 6种农药混合标准溶液的定量离子提取色谱图 Fig. 1 EIC chromatograms of a mixed standard solution of the six pesticides (0.01 mg/L for flubendiamide,and 0.1 mg/L for the others)

比较了丙酮、乙酸乙酯和乙腈的提取效果,发现用丙酮和乙酸乙酯作为提取剂时,会提取出更多的共萃物,对化合物的离子化抑制更强。而用乙腈作为提取剂,则可以大大减少样品基质中蜡质、脂肪和一些亲脂性色素的提取量,并且对各种农药均有较好的提取效率。因此,选择乙腈作为提取溶剂。

为了获得良好的净化效果,实验最初决定选择去除色素和极性杂质效果较好的固相萃取柱进行净化。先后用PSA柱、NH₂柱和Florisil柱,以生菜样品为基质,设计了4种净化方法。方法1:样品不经净化直接上机检测;方法2: PSA柱净化,乙腈作为洗脱剂;方法3: NH₂柱净化,二氯甲烷-甲醇(95 ∶ 5,v/v)作为洗脱剂;方法4: Florisil柱净化,乙腈-甲苯(3 ∶ 1,v/v)作为洗脱剂。采用上述4种方法对6种目标农药在生菜样品中进行添加浓度为0.1 mg/kg 的回收率实验。结果表明,4种方法的回收率均在可接受范围内。对上述4种方法净化制备的生菜空白样品进行一级质谱扫描(见图2),经比对发现,在目标农药出峰时间段,方法4的背景干扰最小,有利于保护仪器,耗材成本也最低。因此本实验最终选择Florisil柱作为固相萃取净化柱。

图2

Fig. 2

图2 采用4种净化方法的生菜样品的一级质谱图 Fig. 2 LC-MS/MS full scan chromatograms of four purification procedures for lettuce

以Florisil柱净化,添加含量为0.1 mg/kg 的生菜基质为样品,比较了以石油醚-丙酮(9 ∶ 1,v/v)、二氯甲烷-甲醇(95 ∶ 5,v/v)和乙腈-甲苯(3 ∶ 1,v/v)为淋洗剂时目标物的回收率。实验发现,石油醚-丙酮作为洗脱剂时目标物回收率不稳定,而二氯甲烷-甲醇和乙腈-甲苯作为淋洗剂时可以得到满意且稳定的回收率。考虑到乙腈的毒性较大,成本较高,本实验选择以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂。

试验发现洗脱剂中甲醇的比例以5%为宜。用Florisil净化柱,二氯甲烷-甲醇(95 ∶ 5,v/v)洗脱即能得到满意的回收率。为了节约溶剂,避免由于洗脱剂过多导致洗脱的杂质量增多的现象发生,本试验对洗脱液体积进行了摸索。分段收集流出液,每5 mL收集1次,收集至20 mL为止,将洗脱液浓缩、定容后进行UPLC-MS/MS测定,计算累计回收率。试验结果表明,洗脱液体积为10 mL时累计回收率达到99%以上,此后收集的洗脱液中药物回收率近乎为0。因此,最终确定洗脱液体积为10 mL。

基质效应是指基质成分和目标化合物在电喷雾离子源进行离子化时相互竞争的结果,包括基质增强效应和基质抑制效应。试验中,用甲醇和不同水果蔬菜的基质溶液分别配制6种农药的检测液,每种农药的质量浓度为0.1 mg/L,在相同条件下检测,按照式(1)对不同种类水果蔬菜基质溶液的基质效应进行量化评估,见图3。｜Mi｜＜20%为弱基质效应,可忽略而无需采取补偿措施;20%≤｜Mi｜≤50%为中等程度基质效应;｜Mi｜＞50%为强基质效应,须采取措施补偿基质效应^[19]。当基质效应在中等程度以上,影响定量结果时,就需要对基质效应进行校正,通常采用的方法有基质匹配标准溶液校正法和样品稀释法。

图3

Fig. 3

图3 水果蔬菜中6种农药的基质效应 Fig. 3 Matrix effects of the six amide fungicides in the different vegetable and fruit matrix solutions

实验选取了5大类水果和6大类蔬菜中具有代表性的11个基质样品,针对6种目标农药进行基质效应评价。结果显示,在西瓜、桃、苹果、葡萄和生菜基质中,6种目标农药均为弱基质效应;在柑橘基质中,溴氰虫酰胺、噻呋酰胺和氟苯虫酰胺为弱基质效应,双炔酰菌胺和啶酰菌胺为中等程度基质效应,氟吡菌胺为强基质效应;在番茄基质中,双炔酰菌胺和氟吡菌胺为中等程度基质效应,其他4种目标农药为弱基质效应;在豇豆和丝瓜基质中,除噻呋酰胺和氟苯虫酰胺为弱基质效应外,其他4种农药均为中等程度基质效应;在杭白菜和甘蓝基质中,溴氰虫酰胺、噻呋酰胺和氟苯虫酰胺为弱基质效应,双炔酰菌胺、啶酰菌胺和氟吡菌胺为中等程度基质效应。

上述结果显示,同种基质溶液中不同农药的基质效应差别比较大,基质越复杂这种差别就越大;如柑橘基质中,氟吡菌胺的｜Mi｜是51.1,为强基质效应;而溴氰虫酰胺｜Mi｜只有10.6,为可以忽略的弱基质效应。这表明基质效应的大小首先与农药品种有关。此外,数据也显示同一种农药在不同样品的基质溶液中,农药基质效应的差别也较大,以氟吡菌胺为例,在桃基质中｜Mi｜只有1.6,而在柑橘基质中｜Mi｜则为51.1,基质效应评价值相差30倍,这说明基质溶液自身的组成对基质效应也有很大的影响。因此,为提高定量的准确性,本实验采用基质匹配标准溶液校正方法对基质效应进行补偿。

参考欧盟2002/657/EC标准^[22],用LC-MS/MS对样品的确证应满足3个条件。首先用方法所测定的所有待测样品的保留时间与外标标准样品保留时间的偏差在±2.5%以内;所选择的定性离子对和定量离子对的信噪比均应大于3(S/N＞3);与外标标准品相比,样品中待测组分的两个定性子离子的相对丰度比在许可的范围内。

经计算在0.01 mg/kg(氟苯虫酰胺0.001 mg/kg)添加水平下,6种农药的相对离子丰度比均能满足各自的最大偏差要求;同时6种农药的定性离子对(m/z 470.9＞145.0溴氰虫酰胺;m/z 412.1＞125.0双炔酰菌胺;m/z 343.0＞271.0啶酰菌胺;m/z 382.9＞364.8氟吡菌胺;m/z 524.8＞166.0噻呋酰胺和m/z 681.0＞272.0氟苯虫酰胺)信噪比分别为7.3、20.5、90.9、9.7、91.9和85.1,可见该添加浓度下完全可以确证,所以确定定量限为0.01 mg/kg(溴氰虫酰胺、双炔酰菌胺、啶酰菌胺、氟吡菌胺和噻呋酰胺)和0.001 mg/kg(氟苯虫酰胺)。而该方法的检出限则根据S/N=3,确定6种农药的检出限为0.001 ng(双炔酰菌胺、啶酰菌胺和氟苯虫酰胺)、0.01 ng(溴氰虫酰胺和噻呋酰胺)、0.000 4 ng(氟吡菌胺)。

将6种农药配制成不同浓度的标准溶液,以峰面积对各农药的浓度进行线性回归,结果(见表2)表明:6种农药的线性关系良好。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 6种农药的线性范围、标准曲线方程、相关系数和检出限 Table 2 Linear ranges,standard curve equations,correlation coefficients (R2) and LODs of the six pesticides Pesticide Linear range/(mg/L) Standard curve equation R2 LOD/ng Cyantraniliprole 0.01-1.0     y=5007x+10.1 0.9999 0.01 Mandipropamid 0.001-1.0     y=33988x+180.6 0.9998 0.001 Boscalid 0.001-1.0     y=25473x+199.0 0.9993 0.001 Fluopicolide 0.0005-1.0     y=83916x+623.9 0.9991 0.0004 Thifluzamide 0.01-1.0     y=6446x-19.55 0.9991 0.01 Flubendiamide 0.002-1.0     y=42668x-369.8 0.9994 0.001 y: peak area; x: mass concentration,mg/L. LOD: S/N=3.

表2 6种农药的线性范围、标准曲线方程、相关系数和检出限 Table 2 Linear ranges,standard curve equations,correlation coefficients (R2) and LODs of the six pesticides

应用本文建立的方法,以生菜、豇豆、苹果和葡萄为试验对象,采用空白样品添加标准溶液的方法,分别做0.01、0.1和1.0 mg/kg(氟苯虫酰胺为0.001、0.01和0.1 mg/kg)3个水平的添加试验。每个添加水平做5个平行样品,同时以空白样品作对照,按照1.4节方法进行提取和净化,并进行检测。由表3可见,6种酰胺类农药的平均回收率均在72.4% ～119.4%之间,相对标准偏差在0.8% ～13.5%(n=5)之间,符合农药残留检测的要求。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 6种农药的平均添加回收率和相对标准偏差(n=5) Table 3 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the six pesticides (n=5) Pesticide Spiked level/ (mg/kg) Lettuce Cowpea Apple Grape Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Cyantraniliprole 0.01 100.0 3.7 106.1 4.8 97.3 5.5 77.0 13.5 0.1 107.5 4.2 104.7 2.3 101.5 2.1 109.4 2.2 1.0 96.0 1.9 114.7 0.8 115.0 2.7 97.5 2.6 Mandipropamid 0.01 104.2 4.6 110.9 6.4 83.4 4.6 78.5 11.0 0.1 115.8 5.1 117.4 1.5 101.9 5.2 114.6 3.8 1.0 96.5 1.1 99.2 1.2 103.3 1.3 87.6 1.8 Boscalid 0.01 101.7 3.0 115.4 1.8 116.9 6.5 95.0 13.2 0.1 110.4 3.6 110.0 3.0 101.9 5.2 115.1 3.3 1.0 87.4 1.2 72.4 1.6 103.3 1.3 74.1 2.6 Fluopicolide 0.01 111.5 3.4 111.0 3.4 85.2 1.5 85.1 11.0 0.1 118.4 4.6 110.4 2.1 105.0 2.7 111.5 5.2 1.0 101.7 1.0 89.5 1.9 89.0 2.3 90.7 1.7 Thifluzamide 0.01 97.4 3.3 108.8 1.9 95.3 5.1 87.2 6.8 0.1 109.8 4.4 98.5 3.1 105.7 1.9 116.8 2.4 1.0 89.5 1.6 93.6 2.1 101.9 2.8 85.8 2.1 Flubendiamide 0.001 75.0 3.3 101.9 7.3 119.4 4.7 85.9 11.4 0.01 110.2 4.6 105.8 3.5 98.9 4.3 113.0 1.9 0.1 76.1 1.3 85.4 2.8 99.7 3.1 75.8 2.6

表3 6种农药的平均添加回收率和相对标准偏差(n=5) Table 3 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the six pesticides (n=5)

采用本文建立的方法对从上海市5个郊区县的农贸市场随机采集的30个蔬菜样品和30个水果样品进行测定。结果发现,1个杭白菜样品中检出溴氰虫酰胺,含量为0.17 mg/kg; 7个样品中检出啶酰菌胺,样品及含量分别为米苋0.02和0.06 mg/kg、草莓0.11、0.14和0.31 mg/kg、茼蒿0.36 mg/kg、菜心2.6 mg/kg; 4个样品中检出氟吡菌胺,样品及含量分别为茼蒿0.02和0.03 mg/kg、菜心0.09 mg/kg、米苋0.01 mg/kg;其他样品中未见目标农药检出。

参考我国或CAC、EU、日本在蔬菜和水果上制定的最大残留限量值(见表4),可以判定所有检出样品均未超标。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 6种农药的最大残留限量 Table 4 Maximum residue limits of the six pesticides Pesticide Sample MRLs/(mg/kg) China CAC EU Japan Cyantraniliprole cabbages / 2 2.0 1 leaf vegetables / 40 5 10 fruiting vegetables / 0.5 0.3 2 strawberries / / / 1 peaches / 1.5 1.5 0.2 Boscalid cabbages / 5 5 5 leaf vegetables / 40 40 40 fruiting vegetables / 3 3 5 strawberries 3 3 15 15 apples 3 2 2 2 Fluopicolide cabbages 0.5* 7 2 5 fruiting vegetables 0.1* 1 1.0 2 leaf vegetables / 30 9 25 grapes / 2 2 2 Mandipropamid cabbages 3* 3 3 3 Tomatoes / 0.3 3 2 leaf vegetables 25* 25 25 25 cucumbers 0.2* 0.2 0.2 0.3 grapes 2* 2 2 3 strawberries / / 0.01 8 Thifluzamide potatoes 2 / / 1 Flubendiamide cabbage 0.2* 4 4 4 grapes / 2 2 2 tomatoes / 5 0.2 2 leaf vegetables / / 7 15 cucumbers / / 0.15 0.7 * Temporary maximum residue limits; CAC: Codex Alimentarius Commission; EU: European Union.

表4 6种农药的最大残留限量 Table 4 Maximum residue limits of the six pesticides

本文通过乙腈提取、Florisil固相萃取柱净化,建立了超高效液相色谱-串联质谱快速检测蔬菜和水果中溴氰虫酰胺等6种酰胺类农药残留量的分析方法。该方法灵敏度高、通用性好,定量限在0.001～0.01 mg/kg 之间,实际样品加标回收率在72.4% ～119.4%之间,可满足酰胺类农药检测的需要。

基质效应是影响LC-MS/MS定量分析准确性的重要因素,因此,在建立方法及方法确认时应对基质效应进行评估,从中寻求更优化的净化方法以降低基质效应,并建立有效的基质效应补偿措施。