凉茶是岭南人民根据本地的气候和水土特性,在长期预防疾病与保健过程中以中医养生理论为指导,以中草药为基础,研制总结出来的具有清热解毒、生津止渴等功效的一类植物饮料^{[1, 2, 3]},深受粤桂港各界人士喜爱,历久不衰。近年来,不法分子由于利益驱使,向凉茶中非法添加化学药物以提高其功效。凉茶是食品,不能宣称疗效,不能添加化学药物,如其中违法添加了化学药物,在凉茶饮用无量的限制情况下,饮用不当将导致多种不良反应和并发症,甚至危及生命^{[4, 5]}。国家对自制出售的凉茶尚未出台强制性标准,卫生及食品药品监管部门对凉茶的监管尚属空白。因此建立一种简便、灵敏、快捷的方法检查产品中是否非法添加化学药物具有重要的现实意义。

目前,非法添加化学药物的研究主要集中在保健食品和中成药上,采用的方法包括薄层色谱法^{[6, 7]}、高效液相色谱法^{[8, 9]}、液相色谱-质谱联用法^{[10, 11, 12, 13]},其前处理方法均比较简单。凉茶中含有大量的亲水性多糖、鞣质、蛋白质以及叶绿素,成分复杂,因此其非法添加化学药物的分析难度较保健食品、中成药大。

QuEChERS方法快速、简便、成本低廉、易于操作,已逐步被应用于多类农药、兽药残留检测^{[14, 15, 16, 17, 18]}。本实验采用改进的QuEChERS方法提取、净化样品,结合超高效液相色谱-串联质谱检测,建立了凉茶中非法添加的12种化学药物的同时快速检测方法,为凉茶的日常监督提供了科学、客观的技术依据。

AB SCIEX Qtrap 4500线性离子阱质谱仪(配电喷雾离子源)(美国Applied Biosystems公司); Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

标准品包括磺胺甲恶唑、富马酸酮替芬、马来酸氯苯那敏、氢化可的松、盐酸苯海拉明、吡罗昔康、盐酸赛庚啶、苯甲酸甲硝唑、美洛昔康、萘普生、 α -细辛脑均购自中国生物制品检定研究院,泼尼松醋酸酯购自德国Dr. Ehrenstorfer公司,纯度均不低于99% ;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵为色谱纯,购自美国Fisher公司;氯化钠、无水硫酸镁为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;水为超纯水。吸附剂C18、PSA(硅胶表面键合-N-丙基乙二胺)、GCB(石墨化炭黑)购自上海安谱科学仪器有限公司。

实验样品购于南宁、梧州、玉林、北海等地市场,包括感冒茶、止咳茶、清热降火茶、祛风除湿茶、喉痛茶等共74个品种。

精密称取各标准品10.0 mg分别置于25 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配成质量浓度为400 mg/L 的标准储备液,在-18 ℃储存。使用时根据需要吸取适量的各化合物标准储备液混合,用甲醇稀释成质量浓度为1.0 mg/L 的混合标准工作液,于-18 ℃下储存。

准确移取样品5.00 mL(精确至0.01 mL)于15 mL聚丙烯塑料离心管中,加入5.00 mL乙腈,振荡1 min后加入0.5 g无水MgSO₄和2.0 g NaCl,涡旋混匀后振荡5 min,于 6000 r/min 离心5 min,收集上清液于另一15 mL离心管(已加入35 mg PSA、65 mg C18和250 mg无水MgSO₄)中,涡旋2 min,于 6000 r/min 离心5 min,取上清液过0.22 μ m有机滤膜,滤液供LC-MS/MS测定。

色谱柱:XBridge BEH C₁₈柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μ m);流动相:A相为乙腈,B相为0.1%(v/v)乙酸水溶液;梯度洗脱程序:0～4 min,15%A～30%A; 4～7 min,30%A; 7～13 min,30%A～50%A; 13～16 min,50%A; 16～17 min,50%A～90%A; 17～20 min,90%A; 20～21 min,90%A～15%A; 21～24 min,15%A。流速:0.5 mL/min;进样量:10 μ L;柱温:40 ℃。

电喷雾离子(ESI)源;正离子扫描;多反应监测(MRM)模式;喷雾电压(IS): 5500 V;离子源温度(TEM): 650 ℃;气帘气(CUR)流速:35 L/min;雾化气(GS1)流速:55 L/min;辅助加热气(GS2)流速:55 L/min;射入电压(EP):10 V;碰撞室射出电压(CXP):13 V;质谱采集参数见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 12种化学药物的保留时间、质谱检测参数、线性范围、线性方程、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 1 Retention times,mass spectrometric parameters,linear ranges,linear equations,correlation coefficients (r), LODs and LOQs for the 12 chemical drugs Drug tR/ min Qualitative ions(m/z) DP/V CE/eV Linear range/ ( μ g/L) Linear equation r LOD/ ( μ g/L) LOQ/ ( μ g/L) Sulfamethoxazole 6.26 254.0/156.0*; 254.0/92.0 80; 80 21; 37 10-400 Y=1.658×104X+3.236×104 0.9998 1.0 4.0 Ketotifen 6.65 310.0/96.0*; 310.0/213.0 80; 80 29; 38 2.0-80 Y=9.115×104X-1.883×104 0.9994 0.2 0.8 Chlorpheniramine 6.91 275.2/167.0*; 275.2/230.1 50; 92 54; 22 2.0-80 Y=1.246×105X-3.680×104 0.9999 0.1 0.4 Hydrocortisone 8.56 363.3/121.1*; 363.3/327.1 120; 120 28; 23 8.0-400 Y=5.925×103X+4.602×104 0.9990 2.1 8.0 Diphenhydramine 8.73 256.2/152.1*; 256.2/167.1 43; 80 50; 19 0.8-40 Y=1.123×105X+3.166×104 0.9998 0.1 0.4 Piroxicam 11.43 332.0/95.0*; 332.0/121.0 80; 80 24; 28 0.8-40 Y=5.194×104X+3.472×103 0.9999 0.1 0.8 Cyproheptadine 11.59 288.2/95.9*; 288.2/191.1 80; 80 32; 40 0.8-40 Y=4.935×104X+8.079×103 0.9998 0.1 0.4 Metronidazole 12.51 276.2/149.1*; 276.2/105.1 70; 60 18; 41 0.8-40 Y=1.164×105X+1.019×104 0.9999 0.1 0.4 Predisone 13.44 401.1/383.2*; 401.1/341.3 100; 100 15; 18 2.0-100 Y=9.218×103X+8.642×103 0.9993 0.5 2.0 Meloxicam 14.17 352.0/114.9*; 352.0/141.0 80; 80 24; 25 0.8-40 Y=1.016×105X-1.979×104 1.0000 0.1 0.8 Naproxen 14.39 231.2/185.0*; 231.2/170.1 80; 80 19; 34 8.0-400 Y=1.177×104X+1.456×104 0.9994 2.0 8.0 α -Asarone 17.07 209.2/194.1*; 209.2/179.0 80; 80 21; 29 4.0-200 Y=9.279×103X+1.078×104 0.9978 1.0 4.0 * Quantitative ion pair. Y: peak area; X: mass concentration,μ g/L.

表1 12种化学药物的保留时间、质谱检测参数、线性范围、线性方程、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 1 Retention times,mass spectrometric parameters,linear ranges,linear equations,correlation coefficients (r), LODs and LOQs for the 12 chemical drugs

在电喷雾正离子模式下分别对1 mg/L 的单个标准溶液进行全扫描,得到每种化合物的分子离子,然后对分子离子进行子离子扫描,选择信号强度较大的两个碎片离子为特征子离子,其中相对丰度最强的为定量离子,其次为定性离子,并优化得到每个化合物的母离子和子离子所需的最佳去簇电压和碰撞能量,最后以多反应监测模式进行扫描。优化得到的质谱参数见表1。

本研究考察了ODS-3(100 mm×2.1 mm，2.1 μ m)、Cortecs C18⁺(100 mm×4.6 mm，2.7 μ m)以及XBridge BEH C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μ m)3种型号的色谱柱对12种化学药物的分离效果,结果发现ODS-3柱分离得到的色谱峰大部分存在峰前伸、分离度差的现象；Cortecs C18⁺存在美洛昔康、吡罗昔康色谱峰拖尾的情况；XBridge BEH C18柱分离得到的色谱峰响应相对较高,且分离度良好。故本实验选择XBridge BEH C18柱进行分离。

实验中考察了水-乙腈、0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、0.1%(v/v)乙酸水溶液-乙腈、0.02 mol/L 乙酸铵溶液-乙腈、0.1%(v/v)乙酸水溶液-0.1%(v/v)乙酸乙腈、0.1%(v/v)甲酸溶液-甲醇和0.02 mol/L 乙酸铵溶液(含0.1%(v/v)乙酸)-乙腈等流动相体系对12种化学药物的色谱峰形、分离度以及信号强度的影响。通过比较发现,含有0.02 mol/L 乙酸铵溶液系统的流动相均抑制萘普生、磺胺甲恶唑、吡罗昔康、美洛昔康以及马来酸氯苯那敏等化合物的电离,大部分化合物的色谱峰均出现不同程度的拖尾及分叉现象;含有甲醇体系的流动相会使大部分化合物色谱峰拖尾、峰形钝化;含有甲酸体系的流动相抑制萘普生的电离致使其不出现色谱信号;0.1%(v/v)乙酸水溶液-乙腈作为流动相,12种化学药物的分离效果好、信号强度相对更高。故本实验选择0.1%(v/v)乙酸水溶液-乙腈作为流动相。

梯度洗脱条件的优化:经过反复试验,改变不同时间段流动相中有机相和水相的比例,最终确定了最佳梯度洗脱条件,获得了12种化学药物的最佳分离效果。12种化学药物的总离子流色谱图见图1。

图1

Fig. 1

图1 12种化学药物混合标准溶液(0.05 mg/L)的 LC-MS/MS色谱图 Fig. 1 LC-MS/MS chromatogram of a mixed standard solution of the 12 chemical drugs (0.05 mg/L) 1． SMZ； 2． ketotifen； 3． chlorpheniramine； 4． hydrocortisone； 5． diphenhydramine； 6． piroxicam； 7． cyproheptadine； 8． metronidazole； 9． predisone； 10． meloxicam； 11． naproxen； 12． α -asarone.

丙酮、乙酸乙酯和乙腈是药物残留分析常用的提取剂。凉茶一般为一种或多种中草药的水溶液提取物,其中含有大量亲水性成分,如无机盐、糖类、中等分子的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及苷类等,基质复杂。与丙酮和乙酸乙酯相比,乙腈的通用性更强,不易提取色素和基质中
的鞣质、蛋白质等成分,故本实验选用乙腈作提取剂。

QuEChERS方法中,PSA、C18和GCB是常见的3种吸附剂。最常用的PSA去除脂肪酸效果较好,但去除色素、甾醇和维生素能力一般;C18可以去除部分色素、甾醇和维生素,但对非极性化合物有较强的吸附;GCB去除色素、维生素和甾醇的能力较好,但对极性化合物的吸附作用较强,特别是对含有芳香环及对称性结构的化合物。本实验考察了PSA-GCB的组合,随着GCB的加入,大部分化合物均无信号。继而考察PSA-C18的组合,当PSA与C18的质量比为35 ∶ 65时,12种化学药物的回收率均能达到60%以上(见图2)。因此选择PSA-C18(35 ∶ 65,m/m)的吸附剂组合。

图2

Fig. 2

图2 吸附剂比例对12种化学药物回收率的影响 Fig. 2 Effect of sorbent ratio on the recoveries of the 12 chemical drugs Spiked herbal teas at 100 μ g/L,mMgSO4: mNaCl=1.5 g ∶ 2.0 g.

QuEChERS方法中,采用饱和盐析方法有利于有机相与水相的分层,减少共提取物质,增加目标物的回收率。为了促使两相快速分层,需要加入过饱和的无水MgSO₄。实验初步固定MgSO₄用量(1.6 g)后对NaCl的用量进行优化^[19],得到NaCl最佳使用量后再对无水MgSO₄的用量进行优化。当无水MgSO₄和NaCl的质量分别为0.5 g 和2.0 g时,兼顾了所有目标化合物的回收率,因此该组合为最佳组合(见图3)。

图3

Fig. 3

图3 除水剂组成比例对12种化学药物回收率的影响 Fig. 3 Effect of water remover ratio on the recoveries of the 12 chemical drugs a. 1.6 g anhydrous MgSO4; b. 2.0 g NaCl. Spiked herbal teas at 100 μ g/L,mPSA: mC18=35 g ∶ 65 g.

取混合标准工作液用甲醇配制成系列标准溶液,分别进样进行测定,以各组分的质量浓度为横坐标,定量离子的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,线性范围、线性方程和相关系数见表1。可见12种化学药物在各自的质量浓度范围内,定量离子的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系,相关系数为 0.9978～1.0000。

在阴性凉茶样品中添加不同浓度的待测物,按本研究建立的方法进行检测,以S/N=10计算方法的定量限,12种化学药物的定量限在0.4～8.0 μ g/L 之间;以S/N=3计算方法的检出限,12种化学药物的检出限在0.1～2.1 μ g/L 之间。

在阴性凉茶样品中分别添加3个水平的12种待测化合物,每个水平平行测定6份样品,考察方法的回收率和精密度,结果见表2。可以看出,12种化合物在3个加标水平下的平均回收率在62.7% ～95.2%之间,相对标准偏差(RSD)在1.3% ～10.8%之间。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 阴性凉茶样品中12种化学药物的加标回收率与相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 12 chemical drugs spiked in a blank sample (n=6) Drug Spiked/( μ g/L) Recovery/% RSD/% Drug Spiked/( μ g/L) Recovery/% RSD/% Sulfamethoxazole 20 67.5 7.2 Cyproheptadine 4 79.5 7.0 50 67.1 3.8 10 77.0 6.9 200 67.0 4.3 40 79.2 5.6 Ketotifen 4 73.4 9.7 Metronidazole 4 88.8 3.9 10 68.1 3.4 10 85.2 6.6 40 65.7 8.5 40 83.4 5.8 Chlorpheniramine 4 89.2 5.7 Predisone 10 67.6 3.2 10 69.9 6.2 25 69.8 4.7 40 80.5 1.7 100 69.4 3.8 Hydrocortisone 40 79.6 10.8 Meloxicam 4 76.3 3.0 100 89.7 2.8 10 71.7 2.8 400 85.5 4.6 40 68.9 2.1 Diphenhydramine 4 94.2 5.3 Naproxen 40 82.7 5.8 10 93.8 7.4 100 63.8 4.7 40 95.2 6.6 400 73.5 2.9 Piroxicam 4 64.0 4.3 α -Asarone 20 77.1 2.8 10 63.3 1.4 50 72.2 3.6 40 62.7 2.0 200 72.5 1.3

表2 阴性凉茶样品中12种化学药物的加标回收率与相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 12 chemical drugs spiked in a blank sample (n=6)

采用本研究建立的检测方法对从南宁、梧州、玉林、北海等地市场购买的74份凉茶样品进行测定。检测结果显示,从降火、止咳、喉痛、感冒茶各1批中检出吡罗昔康,检出量分别为7.2、8.8、23、17 μ g/L;感冒、止咳茶各1批中检出磺胺甲恶唑,检出量分别为162、105 μ g/L;感冒、喉症茶各1 批中检出马来酸氯苯那敏,检出量分别为724、1053 μ g/L; 1批五花祛湿茶检出氢化可的松,检出量为45 μ g/L。其余样品均未检出上述化学药物。

本文将QuEChERS前处理方法应用于凉茶中非法添加化学药物的检测,通过对QuEChERS前处理方法及仪器色谱条件的优化,建立了定性、定量测定凉茶中12种非法添加的化学药物的检测方法。该方法操作简便、灵敏度高,对凉茶基质净化效果好,可用于凉茶中多种非法添加化学药物的快速筛查和确证。

实验结果显示,除马来酸氯苯那敏外,其他几类药物的添加量均较低。尽管如此,非法添加化学药物对凉茶饮用者身体健康影响的风险依然存在。凉茶是两广地区民众喜爱的饮品,民间使用历史悠久,一年四季皆可饮用,尤其是在酷热的盛夏,凉茶更是人们解暑去热的必备之物。然而部分凉茶中非法添加的化学药物,在长期饮用凉茶的情况下就会给身体带来危害。

凉茶的小作坊遍布两广城乡各处的路边摊点，还存在流动摊贩。小作坊目前仍是食品供应的重要组成部分。小作坊操作人员普遍存在食品质量安全知识缺乏、质量卫生控制能力薄弱等问题,从而常常导致食品安全事故发生。因此建议将凉茶的小作坊列入食品质量安全监管的范畴,促进其不断规范和提高,这对从根本上保证凉茶的质量安全,提高整体食品质量安全水平都有着十分重要的意义。