低聚果糖(fructo-oligosaccharides,FOS),又名蔗果低聚糖、寡果糖或蔗果三糖族低聚糖,它是由蔗糖和1～3个果糖基通过 β -1,2糖苷键结合而成的聚合度(DP)为2～9的低聚糖。低聚果糖包括蔗果三糖(1-kestose,GF₂)、蔗果四糖(nystose,GF₃)和蔗果五糖(1-F- β -fructofuranosyl nystose,GF₄)^{[1, 2]}。低聚果糖具有良好的生理功能,特别对人体内微生物环境有双向调节作用,增加人体内有益菌群双歧杆菌,抑制有害菌的繁殖，改善肠道环境，防止便秘;此外还具有降低血清胆固醇、促进人体内B族维生素的合成,预防龋齿、提高机体免疫力等重要功能,又被称作双歧因子^[3]。目前已广泛使用于奶粉、牛奶和乳饮料等各类食品中作为功能性配料^{[4, 5, 6, 7, 8]}。如何准确、快速地对低聚果糖的含量进行检测,成为国家食品安全监管部门和生产厂商迫切需要解决的问题。

食品中添加的低聚果糖主要有两种来源,一种是以蔗糖为原料,由果糖基转移酶转化、精制而得到,其主要成分为GF₂、GF₃和GF₄;另一种是以菊苣或菊芋提取的菊粉为原料,经酶解或酸解而生成的果聚糖,其主要包括果果三糖(inulo-triose,F₂)、果果四糖(inulo-tetraose,F₃)和果果五糖(inulo-pentaose,F₄)^[9]。目前,国家标准中没有相应的检测低聚果糖含量的方法,AOAC 997.08^[10]规定了采用酶解法可以定量检测食物中的果聚糖和低聚果糖,该方法适用于以菊粉为原料经过酶解制得的低聚果糖的定量分析。而国内食品中添加的低聚果糖以第一种来源为主,直接采用适合的溶剂浸提,GF₂、GF₃、GF₄就可以游离出来,无需采用复杂的酶解法处理。

由于低聚糖类物质没有紫外吸收,目前的研究中,对其含量测定通常采用高效液相色谱-示差折光检测器(HPLC-RID)的方法^{[11, 12]}、高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)^{[13, 14]}和离子色谱法^{[15, 16]}。HPLC-RID法要求色谱系统平衡时间较长,分析过程中要求恒温,且无法进行梯度洗脱^[17],同时由于其检测灵敏度不高,只能测定低聚果糖含量较高的样品,而国内添加益生元的食品中低聚果糖的含量在0.5% ～2%(质量分数),因此,HPLC-RID不适用于低聚果糖的测定。HPLC-ELSD和离子色谱法克服了HPLC-RID方法的不足,虽然灵敏度较好,能够达到分析检测的要求,但是抗基质干扰能力差,添加低聚果糖的乳粉和乳制品中一般也会含有一些单糖和双糖,而这些单双糖的分离会影响到低聚果糖的准确定量;对于基质简单的样品,要达到低聚果糖的良好分离度,则需要牺牲分析时间;而对于基质较复杂的样品,HPLC-ELSD和离子色谱法则会存在定量结果不准确以及样品前处理复杂等不足。耿丽娟等^[9]在运用离子色谱法测定奶粉中低聚果糖时前处理还需要用SPE柱进行样品脱脂处理,步骤较繁琐,且分析时间为30 min,不能满足高通量分析。本研究针对基质复杂的乳粉和米粉样品,充分利用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱灵敏度高和抗干扰能力强的特点,建立了一种前处理过程简便、分析时间短、测定结果准确的方法。

四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪Q-Exactive(赛默飞世尔科技公司),配备有HESI-Ⅱ源,液相色谱系统为Dionex 3000高压液相色谱,自动进样器;涡旋混合器(XW-80A型,上海医科大学仪器厂);高速离心机(Sigma,德国公司); LP403分析天平(赛多利斯,德国公司)。

低聚果糖标准样品采用日本株式会社的色谱级标准试剂套装,包含蔗果三糖(纯度99.9% )、蔗果四糖(纯度99.9% )、蔗果五糖(纯度99.9% );乙腈(色谱纯)购自德国Merck公司;冰醋酸(色谱纯)购自美国TEDIA公司;乙酸锌(分析纯)购自南京化学试剂有限公司。所有实验用水均由Milli-Q超纯水系统(美国)制备。

分别精确称量10.0 mg(精确至0.1 mg)蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准品,用超纯水溶解并定容至10 mL,配成1.0 g/L 的标准贮备液,密封保存于4 ℃冰箱中。

标准工作溶液的配制:根据需要,吸取一定量的标准储备液,用水逐级稀释,分别稀释成0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L 低聚果糖混合标准使用液，于4 ℃冰箱中贮存。

准确称取奶粉样品1 g于50 mL容量瓶中,加入约20 mL左右的水,涡旋30 s混合均匀,加入1 mL浓度为10 mmol/L 的乙酸锌水溶液混合均匀后,超声20 min,最后加水定容,混合均匀后取适量溶液采用 2 000 r/min 的离心机高速离心5 min,经0.22 μ m的水相滤膜过滤至进样瓶中,稀释10倍供高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪测定。如果低聚果糖浓度仍较高,可根据线性范围适当稀释。

色谱柱为Agilent Carbohydrate(100 mm×2.1 mm,2.6 μ m);流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B);流速0.60 mL/min;进样量10 μ L;柱温箱温度25 ℃。采用梯度洗脱的分离模式,具体洗脱程序为:0～2 min,80%B; 2～5 min,80%B～20%B; 5～8.5 min,20%B; 8.5～9 min,20%B～80%B; 9～10 min,80%B。

可加热的电喷雾离子源(HESI-Ⅱ);采用正离子扫描模式;毛细管温度320 ℃,鞘气(N₂)流速50 L/min,辅助气(N₂)流速8 L/min,吹扫气(N₂)流速5 L/min;喷雾电压3 kV,透镜电压50 V;采用正离子Target-MS/MS扫描模式;分辨率R=35 000,碰撞能30 eV,AGC target 2e⁵,最大驻留时间100 ms,分离窗口m/z 4.0 。

奶粉基质复杂,含有大量蛋白,因此在实验前,首先选择合适的沉淀剂进行处理。常用除蛋白的方法有乙腈、酸、盐沉淀法和等电点法。虽然乙腈是挥发性的有机溶剂,具有较好的沉淀蛋白的作用,与液相色谱-质谱方法的处理步骤相匹配,但其对于奶粉样品中的蛋白沉淀不完全,因此不使用该方法,实验比较了(A)6%(v/v)冰醋酸水溶液、(B)10 mmol/L 乙酸锌水溶液和(C)等电点调节pH法(用5 mol/L 盐酸调节pH为1.90±0.50,放置2 min,再用5 mol/L 氢氧化钠调节pH为4.70±0.50)3种方法的差异。

以空白国内婴幼儿配方奶粉(S1)和国外某品牌婴幼儿奶粉(S2)为例,比较了不同方法沉淀蛋白的回收率情况,结果如表1所示。中性乙酸锌沉淀蛋白的回收率最高,其次为冰乙酸溶液,而等电点法回收率最低。文献^[4]报道,强酸会分解部分双糖和低聚糖,可能导致等电点法回收率最低。因此,最终选择10 mmol/L 乙酸锌水溶液作为奶粉中低聚果糖测定的蛋白沉淀剂。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 采用不同沉淀蛋白方式处理奶粉样品的比较 Table 1 Comparison of different precipitation methods for milk powder samples Milk sample Precipitation Recoveries/% GF2 GF3 GF4 S1 A 78.3 80.9 84.1 B 83.5 85.6 80.2 C 65.9 70.7 73.3 S2 A 75.2 78.3 73.1 B 78.9 82.4 75.8 C 64.2 68.9 60.6

表1 采用不同沉淀蛋白方式处理奶粉样品的比较 Table 1 Comparison of different precipitation methods for milk powder samples

对于糖的分析,常用的是氨基柱和碳水化合物柱。考虑到色谱柱的使用寿命,选用碳水化合物柱对低聚果糖进行分析。碳水化合物柱属于正相色谱柱,乙腈比例由多到少变化时,对分析物的洗脱能力逐渐增强。实验主要对Carbohydrate(100 mm×2.1 mm,2.6 μ m)和Carbohydrate(150 mm×4.6 mm,5 μ m)两种规格的色谱柱进行了比较。对于低聚果糖标准品的分离,两种色谱柱均显示了相同的较好的分离度;但对于奶粉实际样品的分离,由于 基质复杂、干扰较大,两种色谱柱的效果都不令人满意。大部分添加低聚果糖的奶粉中会含有一些单糖和双糖,而这些单糖和双糖的分离会对低聚果糖的准确定量产生影响,所以实验中选用柱效高、填料粒径较小的2.6 μ m的色谱柱。同时,也确立了梯度洗脱的程序对实际样品进行分离分析,以排除基质干扰的影响。

本实验在ESI⁺模式下,采用流动注射方式,首先对GF₂、GF₃和GF₄进行高分辨质谱全扫描,以准分子离子[M+H]⁺理论精确质量数提取色谱图。在全扫描采集模式下分辨率(R)为 35 000 时,得到一级全扫描的质谱图,分析物相对质量偏差小于5×10^-6。但在实际奶粉样品测定中,发现一级全扫描质谱图提取的色谱峰干扰较大,不能进行准确定量(见图1a)。换用Target-SIM质谱模式后,发现实际样品中的干扰仍然无法消除。

图1

Fig. 1

图1 实际样品中GF2、GF3和GF4的(a)一级全扫描质谱图和(b)二级提取离子流色谱图 Fig. 1 (a) First-full-scan accurate mass spectra and (b) second-extracted chromatograms of GF2,GF3 and GF4 in milk samples

因此在Target-MS/MS模式下,进行二级质谱分离分析,在碰撞能为30 eV时,以[M+H]⁺离子为母离子得到的二级碎片离子的全扫描质谱图见图2,选择丰度相对较高和相对分子质量较大的碎片离子,GF₂、GF₃和GF₄选择的子离子均为 347.079 85,实际奶粉样品没有干扰,具体质谱图如图1b所示。

图2

Fig. 2

图2 GF2、GF3和GF4标准物质的二级全扫描质谱图 Fig. 2 Second-full-scan accurate mass spectra of GF2,GF3 and GF4

基于优化的色谱和质谱条件,采用Orbitrap高分辨质谱对1.2节配制的GF₂、GF₃和GF₄混合标准溶液进行定量分析。分别以各物质二级定量离子的色谱峰面积为纵坐标y、以相应的质量浓度为横坐标x,绘制标准曲线。在空白样品中添加低浓度的各目标化合物,获得信噪比为3(S/N=3)时对应的浓度为此方法的检出限,获得信噪比为10(S/N=10)时对应的浓度为此方法的定量限。所得结果如表2所示。GF₂、GF₃和GF₄的相关系数(r)大于0.998,且在0.1～2.0 mg/L 范围内线性关系良好。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 GF2、GF3和GF4的线性方程、相关系数、保留时间、 检出限和定量限 Table 2 Regression equations,correlation coefficients (r), retention times (tR),limits of detection (LODs,n =5) and limits of quantification (LOQs,n=5) of the GF2,GF3 and GF4 compounds Compound Regression equation r tR/ min LOD/ ( μ g/kg) LOQ/ ( μ g/kg) GF2 y=-886311+0727.9x 0.9980 7.49 100 308 GF3 y=213138+4678.07x 0.9991 7.42 100 308 GF4 y=99909.6+2629.8x 0.9992 7.32 55 154 y: peak area; x: mass concentration,mg/L. Linear range: 0.1-1.0 mg/L.

表2 GF2、GF3和GF4的线性方程、相关系数、保留时间、检出限和定量限 Table 2 Regression equations,correlation coefficients (r),retention times (tR),limits of detection (LODs,n=5) and limits of quantification (LOQs,n=5) of the GF2,GF3 and GF4 compounds

分别对空白国内婴幼儿配方奶粉(S1)和国外婴幼儿奶粉(S2)进行了5、10和20 mg/kg 共3个 不同添加水平的加标回收率试验,对于每个添加水 平重复测定5次,测得GF₂、GF₃和GF₄的回收率范围和相对标准偏差范围见表3,可以看出,回收率在75.8% ～107.3%范围内,RSD在1.6% ～8.3% 范围内。可见,该方法对不同品牌奶粉的检测具有通用性,能够用于日常分析检测。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 2种不同品牌奶粉中GF2、GF3和GF4的加标回收率(n=5) Table 3 Recoveries of GF2,GF3 and GF4 spiked in two different kinds of milk samples (n=5) Milk sample Spiked/(mg/100 g) GF2 GF3 GF4 Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% S1 0.5 83.5 3.5 85.6 4.6 80.2 8.3 1.0 91.4 5.1 101.7 7.2 105.8 4.9 2.0 84.7 6.3 94.1 1.6 107.3 5.6 S2 0.5 78.9 3.9 82.4 5.8 75.8 4.1 1.0 79.2 8.0 90.5 7.6 86.4 6.3 2.0 90.2 5.9 93.4 6.2 104.9 3.7

表3 2种不同品牌奶粉中GF2、GF3和GF4的加标回收率(n=5) Table 3 Recoveries of GF2,GF3 and GF4 spiked in two different kinds of milk samples (n=5)

本研究以实验室从各超市抽查的样品为分析对象,其中包括不同品牌的5种进口婴幼儿奶粉和5种国产奶粉(包括2种孕妇奶粉、2种婴幼儿配方奶粉、1种老年奶粉),按照1.3节的样品前处理方法处理样品,采用优化后的LC-MS/MS条件定性和定量分析奶粉中的低聚果糖,结果如表4所示,可见市售奶粉中的低聚果糖含量基本与标签值一致,只有一个奶粉的低聚果糖值与标签不符,其他都略高于标签值。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 10种奶粉样品中低聚果糖的检测结果及标签值(n=5) Table 4 Determination results and labeled values of fructo-oligosaccharides (FOS) in ten milk powder samples (n=5) Sample No. GF2/(mg/100 g) GF3/(mg/100 g) GF4/(mg/100 g) Total/(mg/100 g) Labeled value/(mg/100 g)  1 1.06 1.82 0.05 2.93 3.0  2 1.39 2.11 0.03 3.53 3.0  3 0.37 0.76 0.36 1.49 1.3  4 1.54 0.12 0.07 1.73 1.5  5 0.39 0.13 0.03 0.55 0.5  6 0.87 0.02 0.47 1.36 1.2  7 0.32 0.66 0.03 1.01 1.0  8 0.45 0.23 0.11 0.79 0.7  9 0.63 0.12 0.32 1.07 0.9 10 0.76 0.31 0.18 1.25 1.0

表4 10种奶粉样品中低聚果糖的检测结果及标签值(n=5) Table 4 Determination results and labeled values of fructo-oligosaccharides (FOS) in ten milk powder samples (n=5)

本研究通过优化样品前处理条件和色谱分离条件,建立了奶粉中低聚果糖的高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测方法。该方法避免了复杂的样品前处理过程,具有分析时间短,样品基质对目标化合物的测定无干扰,精密度和灵敏度高,定量结果准确可靠等优点。应用于实际乳粉样品的检测结果表明,该方法可以较好地识别出市售乳粉中的各组分低聚果糖,并能够对奶粉样品中添加的低聚果糖进行准确定量。