银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶,味甘、苦、涩,性平,归心、肺经;具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂的功效。用于瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫、肺虚咳喘和高脂血症。银杏保健茶是一种具有保健功能的茶叶,采用红茶作基茶,将银杏叶提取物采用科学方法调配至茶叶中,在保证原茶叶的外观、风味不变的情况下,使茶叶的营养更加丰富,能起到更好的保健作用,具有改善记忆力、清除氧自由基、改善心脑循环、延缓衰老的作用,且质量稳定,副作用小,可长期食用。

银杏叶提取物的有效成分主要为黄酮类化合物(flavonoids),茶叶中也含有黄酮类化合物。黄酮类化合物具有多方面的生物活性,如儿茶素具有抗脂肪肝作用及抗癌和维生素P样作用^[1];牡荆素具有活血化瘀、理气通脉之功效,还是防癌抗肿瘤的天然药物成分;木犀草素和黄芩素具有抗菌、降压和清热解毒的作用;槲皮素、山柰酚、异鼠李素、柚皮素、橙皮素具有抗氧化、抗炎症、抗癌等生物活性^{[2, 3, 4, 5]}。

黄酮类化合物是自然界存在的一大类物质,其种类多,在植物体内大部分与不同的糖结合成苷,因此使得其更加复杂多样,不易测定,建立合理的测定方法是分析工作中的难题。目前常用黄酮类物质的测定方法有分光光度法^[6]、高效液相色谱法(HPLC)^{[7, 8]}、液相色谱-质谱联用法^{[9, 10]}。分光光度法只能测定总黄酮的含量,原理是通过颜色反应后比色定量,实际测试过程中由于杂质干扰严重,导致定量准确性差、重现性低;高效液相色谱法大多只对少数几种黄酮进行定量,且分离度要求高;有文献采用液相色谱-质谱联用研究黄酮类物质,但多数只着重于槲皮素、山柰酚、异鼠李素、儿茶素等少数几种成分的定性鉴别或结构确证^[11]。本研究对常见的、功效明确的16种黄酮及黄酮苷元(见表1),建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)同时测定该类物质的方法,目前未见报道。通过测定发现银杏保健茶中含量较高的9种成分为山柰酚、槲皮素、橙皮素、牡荆素、木犀草素、儿茶素、芹菜素、柚皮素、异鼠李素,选择这9种成分作为质控指标符合现代保健品及中成药多指标质量控制要求。该方法快速、准确、抗干扰力强,可用来监测保健茶的稳定性及控制银杏保健茶的质量。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 16种黄酮的分子式和相对分子质量 Table 1 Molecular formulae and relative molecular masses of the 16 flavonoids No. Component Molecular formula Relative molecular mass 1 catechin C15H14O6 290 2 puerarin C21H20O9 416 3 vitexin C21H20O10 432 4 isoflavoues aglycone C15H10O4 254 5 luteolin C15H10O6 286 6 quercetin C15H10O7 302 7 silymarin C25H22O10 482 8 apigenin C15H10O5 270 9 naringenin C15H12O5 272 10 hesperitin dihydrochalcone C16H16O6 304 11 kaempferol C15H10O6 286 12 hesperitin C16H14O6 302 13 isorhamnetin C16H12O7 316 14 baicalein C15H10O5 270 15 nobiletin C21H22O8 402 16 tangeretin C20H20O7 372

表1 16种黄酮的分子式和相对分子质量 Table 1 Molecular formulae and relative molecular masses of the 16 flavonoids

Agilent 1200 LC/6410B MS液相色谱/串联四极杆质谱联用仪(美国Agilent公司); Sartorious BP2HD电子天平(美国Sartorious公司);HWS12型水浴锅(上海一恒科技仪器有限公司)。

对照品:儿茶素(批号110877-201203,纯度97.2% )、葛根素(批号110752-200912,纯度95.5% )、牡荆素(批号111687-200602,纯度100% )、大豆苷元(批号1502-200101,纯度95.0% )、木犀草素(批号111520-200504,纯度100% )、槲皮素(批号100081-200907,纯度100% )、水飞蓟宾(批号110856-200604,纯度100% )、芹菜素(批号111901-201102,纯度98% )、山柰酚(批号110861-201209,纯度98.1% )、橙皮素(批号110721-201014,纯度95.1% )、异鼠李素(批号110860-201109,纯度99.0% )、黄芩素(批号111595-201306,纯度97.8% )均购自中国药品生物制品检定所;川陈皮素(纯度
98% )、桔皮素(纯度98% )和柚皮素(纯度100% )、橙皮素二氢查尔酮(纯度＞95% )购自金测分析技术(天津)有限公司;银杏保健茶(批号:130411、130421、130425、130429、130502、130513)购自广州悦榕医药科技有限公司;乙腈为色谱纯(德国Merck公司);甲酸为LC-MS级(美国Sigma公司);甲醇、盐酸为分析纯(广州化学试剂厂);实验用水为二次蒸馏水。

分别取各对照品适量,用甲醇溶解制成质量浓度约500 mg/L 的对照品储备液,置于冰箱2-8 ℃保存(2个月内使用),临用时用甲醇将上述储备液稀释为8种不同浓度的混合对照品溶液。

实验参考了《中国药典》2010年版一部中银杏叶提取物项下总黄酮苷的测定方法。取本品中粉约0.1 g,精密称定,置于50 mL圆底烧瓶中,精密加入甲醇-25%盐酸溶液(4 ∶ 1,v/v)混合溶液10 mL,摇匀,90 ℃加热回流60 min,放冷,过滤,精密量取续滤液4 mL至10 mL容量瓶中并加甲醇至刻度,摇匀,过0.20 μ m微孔滤膜,滤液供HPLC-MS/MS测定。

色谱柱:Agilent Zorbax C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm,2 μ m);流动相:A为乙腈,B为0.1%(v/v,下同)甲酸水溶液;梯度洗脱程序:0～4 min,15%A～60%A; 4～6 min,60%A～80%A; 6～7 min,80%A～15%A; 7～12 min,保持15%A。流速为0.25 mL/min;采集时间为12 min;柱温为30 ℃;进样量为2 μ L。

电喷雾(ESI)离子源,正离子电离模式;干燥气(N₂)温度350 ℃,流量10 L/min;雾化气(N₂)压力275.8 kPa;电喷雾电压 4000 V;扫描方式为多反应监测(MRM)模式,各成分的质谱分析参数见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 16种黄酮成分的保留时间及质谱分析参数 Table 2 Retention times and HPLC-MS/MS parameters of the 16 flavonoids No. Component Retention time/min Parent ion (m/z) Daughter ion (m/z) Collision energy/V Fragmentor voltage/V 1 catechin 3.04 291 139* 15 100 123 20 100 2 puerarin 3.32 417 297* 35 135 267 35 135 3 vitexin 4.52 433 313* 20 135 415 10 135 4 isoflavoues aglycone 5.79 255 199* 25 80 227 25 80 5 luteolin 5.94 287 153* 40 100 135 40 100 6 quercetin 6.02 303 153* 40 135 299 40 135 7 silymarin 6.20 483 153* 15 135 195 15 135 8 apigenin 6.43 271 153* 35 80 119 30 80 9 naringenin 6.46 273 153* 25 80 119 30 80 10 hesperitin dihydrochalcone 6.54 305 137* 20 100 179 5 100 11 kaempferol 6.54 287 153* 35 100 258 30 100 12 hesperitin 6.59 303 177* 15 135 153 25 135 13 isorhamnetin 6.59 317 302* 25 135 153 35 135 14 baicalein 6.66 271 123* 35 80 169 35 80 15 nobiletin 7.48 403 373* 30 135 388 20 135 16 tangeretin 8.03 373 343* 25 135 325 25 135 * Quantitative ion.

表2 16种黄酮成分的保留时间及质谱分析参数 Table 2 Retention times and HPLC-MS/MS parameters of the 16 flavonoids

取对照品储备液适量,用甲醇配制质量浓度分别为10、5、1、0.5、0.1、0.025、0.01、0.001 mg/L 的系列混合对照品溶液(现配现用),上机测定。以定量离子峰面积为纵坐标,对照品溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线。样品测定后以定量离子峰面积为指标,标准曲线法定量。

本研究曾试验采用分光光度法测定保健茶中的总黄酮^[12],结果发现,用芦丁作对照品时,采用不同提取溶剂(70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇)提取、聚酰胺柱净化,得到的结果相差5倍之多。分光光度法前处理过程长,结果不稳定,难以控制产品质量。试验还参考《中国药典》2010年版一部中银杏叶提取物项下测定总黄酮醇(包括槲皮素、山柰酚和异鼠李素),通过测定3种物质含量的和乘以系数2.51得到总黄酮醇,该法只能测定这3种物质,不能全面地反映保健茶的质量;本法将样品水解后使不同结合态的黄酮苷转变成几种常见的苷元形式,再用液相色谱-质谱联用法测定,能定量多种黄酮类物质,覆盖面广。比如测定水解液中的一种橙皮素,就代表原液中的橙皮苷、新橙皮苷^[13]以及其他以橙皮素为苷元结合其他糖类的黄酮化合物,具有典型的代表性。

16种黄酮类化合物的结构相似,需要选择合适的色谱柱将其分离,尤其是其中3对同分异构体木犀草素和山柰酚(m/z 287)、芹菜素和黄芩素(m/z 271)、槲皮素和橙皮素(m/z 303)的分离,试验分别试用了不同型号的色谱柱:Thermo C₈ (150 mm×2.1 mm,2 μ m)、Thermo C₁₈ (150 mm×2.1 mm,2 μ m)和Agilent Zorbax C₁₈ (100 mm×2.1 mm,2 μ m)色谱柱,结果(见图1)显示:Agilent Zorbax C₁₈色谱柱对于各种物质的分离效果比较理想。对比了A、B、C 3种流动相体系(A:乙腈-0.1%甲酸水溶液;B:乙腈-0.1%甲酸水溶液(含甲酸铵10 mmol/L); C:甲醇-0.1%甲酸水溶液(含甲酸铵10 mmol/L)),结果表明,使用A体系时各物质灵敏度高、检出限低,检出限最低的川陈皮素和橘皮素能达到0.1 μ g/L;使用B体系时异构体橙皮素和槲皮素不能分离;使用C体系作流动相时槲皮素的检出限只能达到0.1 mg/L;综合以上各因素,得到最佳色谱条件为:Agilent Zorbax C₁₈色谱柱,乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱。在此条件下检测得到16种黄酮的MRM图如图2所示,其中木犀草素以保留时间为5.94 min的峰进行定量;槲皮素以保留时间为6.02 min的峰进行定量;山柰酚以保留时间为6.54 min的峰进行定量。混合对照品溶液的16种黄酮的总离子流色谱图以及样品溶液的16种黄酮的总离子流色谱图分别如图3a、图3b所示,由于16种黄酮中有3对同分异构体,化学结构相似,因此要达到很好的分离度较难;另外,由于这3对同分异构体的相对分子质量接近,所以保留时间集中在6.5～7.0之间,对于其中相同的定量离子根据不同的保留时间来区分,如:木犀草素和山柰酚的定量碎片离子均为m/z 287＞153,而木犀草素的保留时间为5.94 min,山柰酚的保留时间为6.54 min,从而加以区分(图3a和图3b中峰1和峰2的保留时间稍有不同可能是因为本底基质效应或者本底响应值的差异导致的)。

图1

Fig. 1

图1 3种不同色谱柱分离的总离子流图 Fig. 1 TIC of three kinds of column a. Thermo C8 (150 mm×2.1 mm,2 μ m); b. Thermo C18 (150 mm×2.1 mm,2 μ m); c. Agilent Zorbax C18 (100 mm×2.1 mm,2 μ m). 1. catechin; 2. puerarin; 3. vitexin; 4. isoflavoues aglycone; 5. luteolin; 6. quercetin; 7. silymarin; 8. apigenin; 9. naringenin; 10. hesperitin dihydrochalcone; 11. kaempferol; 12. hesperitin; 13. isorhamnetin; 14. baicalein; 15. nobiletin; 16. tangeretin.

图2

Fig. 2

图2 16种黄酮类化合物的MRM谱图 Fig. 2 MRM chromatograms of the 16 flavonoids 1. catechin; 2. puerarin; 3. vitexin; 4. isoflavoues aglycone; 5. luteolin (retention time,5.94 min); 6. quercetin (retention time,6.02 min); 7. silymarin; 8. apigenin; 9. naringenin; 10. hesperitin dihydrochalcone; 11. kaempferol(retention time,6.54 min); 12. hesperitin; 13. isorhamnetin; 14. baicalein; 15. nobiletin; 16. tangeretin.

图3

Fig. 3

图3 (a)16种黄酮类化合物混合标准溶液及(b)样品溶液的总离子流色谱图 Fig. 3 TIC of (a) a mixed standard solution of the 16 flavonoids and (b) a sample solution 1. catechin; 2. puerarin; 3. vitexin; 4. isoflavoues aglycone; 5. luteolin; 6. quercetin; 7. silymarin; 8. apigenin; 9. naringenin; 10. hesperitin dihydrochalcone; 11. kaempferol; 12. hesperitin; 13. isorhamnetin; 14. baicalein; 15. nobiletin; 16. tangeretin.

黄酮类化合物主要是基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物,母核上有-OH,-OCH₃等不同取代基,而且结构中具有碱性氧原子,因此选用ESI⁺作为离子化模式,16种黄酮均易得到一个质子形成[M+H]⁺准分子离子峰,作为母离子。分别对母离子进行碰撞诱导解离,以获得二次碎裂产生的子离子。分别选择离子丰度高、基线噪声低的两对离子对作为定性离子对,选择其中离子丰度最高的离子对作定量离子对;在此基础上逐个优化了对灵敏度影响较大的碰撞能量和源内碎裂电压,使选定的子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳。最后得到优化后的参数见表2。

为了使测定的黄酮类物质覆盖面广,前处理采用2 mol/L 的盐酸水解,可将多种结合态的黄酮转化成黄酮苷元后测定。采用处理后加标法考察了基质效应^{[14, 15]},以加标后测出浓度对应加入浓度计算基质效应,结果发现基质对部分黄酮成分有一定的抑制效应,但基质抑制效应均<10% ,可能是由于各物质达到充分分离以及样品是稀释了250倍之后检测,所以基质对目标物质定量影响不大,因此本方法可以不考虑基质效应对定量的影响。

将上述质量浓度为10、5、1、0.5、0.1、0.025、0.01、0.001 mg/L 的16种混合对照品溶液分别在最优条件下测定,得出16种物质浓度与峰面积的关系,以S/N=3确定方法的检出限,以S/N=10确定方法的定量限,检出限、定量限及线性回归方程等参数见表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 16种黄酮类化合物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限 Table 3 Linear regression equations,linear ranges,correlation coefficients,LODs and LOQs of the 16 flavonoids No. Component Regression equation Linear range/ (mg/L) Correlation coefficient LOD/ (mg/L) LOQ/ (mg/L) 1 catechin y=9168x+995 0.025-10 0.9991 0.0100 0.025 2 puerarin y=125466x+2297 0.001-1 0.9996 0.0003 0.001 3 vitexin y=17959x+2162 0.025-5 0.9990 0.0100 0.025 4 isoflavoues aglycone y=79789x+7581 0.010-5 0.9988 0.0010 0.010 5 luteolin y=31173x+6513 0.025-5 0.9987 0.0100 0.025 6 quercetin y=10793x+1130 0.010-10 0.9992 0.0010 0.010 7 silymarin y=8742x+156 0.010-1 0.9990 0.0010 0.010 8 apigenin y=60510x+9978 0.010-5 0.9987 0.0010 0.010 9 naringenin y=14815x+1538 0.010-5 0.9998 0.0010 0.010 10 hesperitin dihydrochalcone y=52225x+754 0.010-10 0.9996 0.0010 0.010 11 kaempferol y=7321x+3292 0.050-10 0.9968 0.0100 0.050 12 hesperitin y=17330x+1112 0.050-10 0.9989 0.0010 0.050 13 isorhamnetin y=16413x+729 0.010-1 0.9990 0.0010 0.010 14 baicalein y=24750x+4202 0.010-5 0.9988 0.0010 0.010 15 nobiletin y=3594400x+69034 0.001-5 0.9989 0.0001 0.001 16 tangeretin y=5503793x+93458 0.001-5 0.9988 0.0001 0.001 y: peak area; x: mass concentration,mg/L.

表3 16种黄酮类化合物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限 Table 3 Linear regression equations,linear ranges,correlation coefficients,LODs and LOQs of the 16 flavonoids

取约0.11 g到0.12 g的银杏保健茶样品(批号:130411),精密称定,水解前分别添加1、10、50 mg/L 3种水平的标准溶液1 mL,每个浓度平行做6个样品,按1.3节方法处理,分别进行加标回收试验和精密度试验,取6次测定的平均值,16种黄酮成分在3种不同添加浓度下的回收率都在70.9% ～100.0%之间,RSD<10%(见表4)。取对照品溶液在一日内的不同时间点(共6个时间点,间隔控制在4 h)测定和在不同日期(3天内的同一时间)测定,除了儿茶素只在12 h内稳定以外,其他黄酮类成分的日内RSD均小于5.0% ,日间RSD均小于10% ;另取水解后的样品溶液在一日内的不同时间点(共6个时间点,间隔控制在4 h)测定,16种黄酮类成分的RSD值均小于10% ,满足定量分析要求。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 16种黄酮成分的加标回收率及RSD (n=6) Table 4 Recoveries and RSDs of the 16 flavonoids (n=6) No. Component Background/( μ g/g) Added/ μ g Found/ μ g Average recovery/% RSD/% 1 catechin 290.4 1 32.9 70.9 2.4 10 43.8 72.7 6.1 50 73.1 74.1 6.4 2 puerarin 0.89 1 0.87 77.1 5.7 10 7.4 72.8 9.0 50 36.1 72.0 9.3 3 vitexin 903.7 1 101 77.2 6.3 10 121 76.5 5.3 50 152 78.6 9.7 4 isoflavoues aglycone 2.5 1 1.1 87.2 6.1 10 9.0 86.5 4.1 50 43.7 86.8 7.2 5 luteolin 187.2 1 21.5 79.2 8.3 10 31.1 75.9 7.3 50 62.3 78.1 5.5 6 quercetin 1658.1 1 185.6 82.6 6.1 10 217.0 81.0 7.3 50 245.0 79.1 7.1 7 silymarin 2.7 1 1.3 100 3.4 10 10.2 98.8 3.6 50 50.4 100 7.1 8 apigenin 134.2 1 15.8 87.4 8.0 10 25.7 88.6 6.3 50 61.7 90.0 3.4 9 naringenin 174.7 1 20.1 74.7 9.8 10 30.1 80.9 7.6 50 59.9 76.4 9.0 10 hesperitin dihydrochalcone 3.8 1 1.3 88.8 7.7 10 9.5 89.8 7.5 50 42.9 84.9 5.4 11 kaempferol 3168.9 1 352.0 80.4 7.1 10 407.6 85.4 6.8 50 433.0 79.9 4.9 12 hesperitin 1696.1 1 189.0 77.2 6.3 10 221.2 76.5 5.3 50 250.5 78.6 9.7 13 isorhamnetin 172.0 1 19.9 81.7 9.4 10 29.2 75.7 6.3 50 66.2 89.8 3.5 14 baicalein 24.5 1 3.5 80.5 6.8 10 10.8 77.7 7.4 50 42.3 78.6 9.7 15 nobiletin 1.2 1 0.9 82.1 3.8 10 8.3 81.9 6.5 50 43.5 86.7 7.4 16 tangeretin 1.8 1 1.0 77.7 7.3 10 8.7 84.2 4.7 50 38.1 75.8 6.4

表4 16种黄酮成分的加标回收率及RSD (n=6) Table 4 Recoveries and RSDs of the 16 flavonoids (n=6)

采用该方法检测了6批保健茶产品银杏保健茶(批号:130411、130421、130425、130429、130502、130513)，检测数据见表5。结果显示6批银杏保健茶的16种黄酮类成分的总含量均在0.8%左右,山柰酚、槲皮素、橙皮素、牡荆素、木犀草素、儿茶素、芹菜素、柚皮素、异鼠李素9种主要成分均占16种黄酮成分的99.5%以上,说明该6批银杏保健茶质量优良、稳定性好。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 6批样品的16种黄酮成分的含量 Table 5 Contents of the 16 flavonoids in six batches of samples No. Component Contents/( μ g/g) 130411 130421 130425 130429 130502 130513 1 catechin 283.0 283.0 305.0 300.0 330.0 337.0 2 puerarin 1.000 0.800 0.900 ND 0.900 0.800 3 vitexin 511.0 846.0 757.0 801.0 789.0 783.0 4 isoflavoues aglycone 2.200 2.400 2.600 2.700 1.800 2.100 5 luteolin 166.0 186.0 207.0 190.0 179.0 183.0 6 quercetin 1380 1600 1990 2130 1930 1950 7 silymarin 3.000 2.900 2.200 2.700 2.900 2.900 8 apigenin 114.0 117.0 146.0 161.0 119.0 125.0 9 naringenin 169.0 181.0 174.0 175.0 165.0 184.0 10 hesperitin dihydrochalcone 3.200 3.700 4.300 4.100 2.900 3.100 11 kaempferol 3260 3140 3360 2910 2800 2880 12 hesperitin 1320 1520 1900 2050 1850 1850 13 isorhamnetin 162.0 166.0 168.0 195.0 167.0 169.0 14 baicalein 20.10 26.70 29.60 21.40 23.30 22.90 15 nobiletin 1.200 1.100 1.100 1.200 1.100 1.200 16 tangeretin 1.900 1.800 1.600 1.900 1.900 16.50 Sum/( μ g/g) 7400 8080 9050 8950 8360 8510 Proportion of the major nine flavonoids/% 99.60 99.50 99.50 99.60 99.60 99.60 ND: not detected.

表5 6批样品的16种黄酮成分的含量 Table 5 Contents of the 16 flavonoids in six batches of samples

本文建立了液相色谱-串联质谱法同时测定银杏保健茶中儿茶素、牡荆素、葛根素、大豆苷元、水飞蓟宾、槲皮素、木犀草素、芹菜素、柚皮素、橙皮素二氢查尔酮、山柰酚、橙皮素、异鼠李素、黄芩素、川陈皮素、桔皮素等16种黄酮类物质。本法简便、快速、准确可靠,可用来控制银杏保健茶的质量。最终选择含量较高的山柰酚、槲皮素、橙皮素、牡荆素、木犀草素、儿茶素、芹菜素、柚皮素、异鼠李素9种成分作为质控指标,建立银杏保健茶的质量控制标准,符合现代中药复方多成分、多指标质量控制的理念。