骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病, 其特征为骨量低下, 骨微结构破坏, 骨脆性增加[1, 2]。六味地黄汤是中医临床治疗骨质疏松症的经典名方[3], 由牡丹皮、泽泻、酒萸肉、山药、熟地黄、茯苓6味中药材组成[4]。但是六味地黄汤成分复杂[5], 其抗骨质疏松药效物质尚不明确, 已成为方剂现代化研究的瓶颈。
细胞膜色谱法(CMC)是一种新型生物亲和色谱法, 已成为中药活性成分筛选的有效工具, 并得到广泛关注[6]。CMC的原理是利用细胞膜上的靶点(受体、通道、酶)可以与药物结合, 具有色谱分离和细胞膜活性筛选的双重特性[7], 能够实现复杂样品中活性成分的高通量筛选[8]。本课题组前期发现，成骨细胞是骨质疏松症药物的重要靶标细胞[9], 与成骨细胞膜亲和的成分有可能成为抗骨质疏松药物[10]。因此, 本工作构建了CMC/UPLC-TOF/MS色谱分析系统, 快速识别、分离及鉴别六味地黄汤中潜在的抗骨质疏松活性成分, 并对筛选结果进行体内外药效验证。
ExionLCAD超高效液相色谱-X-500R TOF高分辨质谱(AB Sciex, 美国); LC 20AT高效液相色谱仪(岛津, 日本); 纯水机(Millipore, 美国), JY92Ⅱ细胞粉碎仪(宁波新芝, 中国); 20R低温离心机(贝克曼, 美国); DM2500显微镜(莱卡, 德国)。
地塞米松(纯度＞99%)和降钙素(纯度＞98%)购自上海阿拉丁试剂公司; 梓醇(批号MUST-13030609)、5-羟甲基糠醛(批号BWB50736)、烟酰胺(批号BWB51504)、芍药苷(批号BWB50095)、天冬氨酸(批号BWB51495)、松果菊苷(批号BWB50855)、桃叶珊瑚苷(批号BWB50835)、咖啡酸(批号BWB50562)、黄芪苷(批号BWB50473)、琥珀酸(批号BWB50513)和亚油酸(批号BWB51916)均购自北京奥科生物科技有限公司。8-表番木鳖酸(批号YB000201)购自上海钰博生物有限公司。齐墩果酸(批号110709-200304)、丹皮酚(批号0708-9704)购自中国药品生物制品检定所。异亮氨酸(批号140624-201506)、毛蕊花糖苷(批号111530-201713)购自中国食品药品检定研究院。多聚甲醛、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、茜素红-S(AR-S, 分析纯)、Tris和α -minimum Eagle’s medium培养基(α -MEM)购自江苏凯基生物技术股份有限公司。硅胶(5 μ m)购自青岛美高化工有限公司。中药饮片牡丹皮、泽泻、酒萸肉、山药、熟地黄、茯苓购自浙江华东医药集团。乙腈(色谱级)和甲醇(色谱级)均购自德国默克公司。细胞活性测定试剂盒(CCK-8)购自南京建成生物工程研究所。
称取牡丹皮6 g、泽泻6 g、山茱萸8 g、山药8 g、熟地黄16 g、茯苓6 g, 粉碎后置于5 000 mL圆底烧瓶中[11]。加入1 000 mL水回流提取1 h, 重复2次。合并滤液, 浓缩后再加入80 mL的乙醇以沉淀多糖和蛋白质。静置过夜, 取上清液浓缩至生药质量浓度为90 g/L, 以待用。
将地塞米松和降钙素分别溶于水, 制成1 g/L的标准溶液。
将培养的成骨细胞用PBS洗涤3次, 然后于4 ℃下以1 000 r/min离心10 min。加入10 mL PBS形成细胞悬浮液, 随后用细胞破碎仪破裂细胞(400 W, 超声2 s, 冷却5 s, 20个循环)。将混合物于4 ℃下以1 000 r/min离心10 min。弃去沉淀, 上清液于4 ℃下以15 000 r/min离心20 min。将沉淀与5 mL PBS混合, 涡旋5 min, 成为细胞膜悬液。在真空下加入0.05 g硅胶(5 μ m)。于4 ℃孵育12 h后, 混合物用5 mL PBS洗涤3次, 于4 ℃下以100 r/min离心10 min, 所得沉淀即为CMC固定相, 将其装入不锈钢色谱柱(10 mm×2 mm)中, 作为细胞膜色谱柱。
样品为六味地黄丸提取物、降钙素溶液和地塞米松溶液, 将成骨细胞CMC柱连接于LC-20AT HPLC。柱温为37 ℃, 流动相为超纯水, 流速为0.1 mL/min, 进样量为5 μ L, 检测波长为270 nm。
分析柱为WATERS ACQUITY UPLC BEH C18 (10 mm×2 mm); 流动相为(A)水和(B)乙腈; 流速为0.4 mL/min。梯度洗脱条件:0~3 min, 90%A~80%A; 3~8 min, 80%A~75%A; 8~11 min, 75%A~65%A; 11~15 min, 65%A~55%A。
离子源:ESI源, 正、负离子模式; 离子源气体压力：3.8×105 Pa；离子源温度：600 ℃; 去簇电压：60 V; 碰撞能:35 V。
首先, 将筛选化合物的水溶液(1×10-8 mol/L)作为流动相, 依次通过细胞膜色谱柱。待细胞膜色谱柱饱和后, 再将降钙素水溶液(1×10-7mol/L)分别通过上述细胞膜色谱柱, 记录降钙素突破曲线的变化。当梓醇、丹皮酚和降钙素溶液作为流动相时, 检测波长为270 nm, 当齐墩果酸溶液作为流动相时, 检测波长为210 nm。
细胞试验:在96孔板中培养成骨细胞[12], 每孔5×103个细胞。加入筛选化合物处理细胞24 h。随后按照CCK-8细胞活性测试盒的要求检测细胞活性。
骨质疏松斑马鱼试验:取受精后5 d的斑马鱼幼鱼, 将其分成3组, 分别置于24孔板中, 每组放2个孔, 每个孔放入10条幼鱼, 模型组给予25 μ mol/L泼尼松龙模型药, 梓醇组给予25 μ mol/L梓醇溶液和25 μ mol/L泼尼松龙模型药。置于28.5 ℃的恒温培养箱中培养, 每天进行换药, 培养5 d, 进行骨矿化量分析[13]。
通过降钙素阳性样品和地塞米松阴性样品对CMC/UPLC-TOF/MS系统进行适用性考察。降钙素属于G蛋白偶联受体家族[14], 是一种调节骨代谢的重要激素[15]。成骨细胞表面存在着大量的降钙素受体, 能与降钙素结合后促进成骨细胞的活性[16]。如图 1a所示, 降钙素在CMC上有所保留, 保留时间为10 min左右, 表明在此系统中降钙素显示良好的保留特性。地塞米松的作用靶标在细胞内[17], 因而与细胞膜结合力较弱, 在R0峰冲洗出来。结果表明, 该系统可以对成骨细胞亲和成分进行识别、分析和鉴定。
对使用10 d的CMC固定相进行红外表征，结果可以看出, 3 430 cm-1处是酰胺的N-H振动峰, 1 539 cm-1处是酰胺的羰基峰, 2 929 cm-1处是亚甲基的峰, 1 652 cm-1处是P-O的伸缩振动峰(见图 2)。红外表征结果进一步说明了成骨细胞膜裹在硅胶上, 使用一段时间后仍然比较稳定。
将未使用和连续使用10 d的细胞膜色谱固定相进行扫描电镜表征(见图 3)。可以看出, 细胞膜色谱固定相和硅胶固定相具有显著区别, 经硅胶与细胞膜共同孵育后, 成骨细胞膜可以稳定地覆盖在硅胶表面。使用10 d的细胞膜色谱固定相与未使用的固定相的微观结构未见显著差异。
本工作对硅胶、未使用的细胞膜色谱固定相以及使用10 d的细胞膜色谱固定相中的C、H、N元素含量进行了分析(见图 4)。分析结果表明, 硅胶中的C含量和N含量几乎为0。经成骨细胞膜修饰后, CMC固定相的C、H、N含量显著增加, 分别为3.13%、1.01%和0.63%, 这是因为细胞膜中含有碳水化合物和蛋白质等物质。使用10 d后, CMC固定相的C、H、N含量分别为3.03%、0.99%和0.61%, 与未使用的CMC固定相相比没有显著性差异。说明细胞膜能够较为稳定地包裹硅胶表面。
以六味地黄汤(90 g/L)为样品, 采用CMC分析, 收集8~30 min时间段的保留组分R1(见图 5), 进行UPLC-TOF/MS分析(见图 6)。通过对比可以看出, 六味地黄丸提取物的色谱峰数目多于保留成分的色谱峰。这是因为六味地黄丸提取物中有许多成分并未在CMC固定相上保留。通过定性分析可知, 采用CMC/UPLC-TOF/MS能在六味地黄汤提取物中筛选出16种活性成分, 具体筛选结果见表 1。CMC保留成分与成骨细胞具有良好的亲和作用, 具有潜在的抗骨质疏松活性。
亲和色谱法能够模拟研究人体内药物与蛋白质的动态结合过程, 因而在小分子药物与生物大分子相互作用的研究中受到了广泛关注[18]。前沿色谱法是动态条件下测定被分析物与固定相亲和强度的常用方法[19]。在16种成分中, 梓醇、齐墩果酸和丹皮酚在六味地黄汤样品(90 g/L)中的含量相对较高, 分别为62.4、103.4和84.3 mg/L。梓醇是六味地黄汤君药熟地黄的主要成分[21], 齐墩果酸和丹皮酚是牡丹皮的主要成分。
本工作进一步采用前沿色谱法对比了梓醇、齐墩果酸和丹皮酚这3种化合物在成骨细胞膜色谱上的亲和强度。梓醇、齐墩果酸和丹皮酚的突破曲线如图 7a所示, 吸附曲线拐点分别位于17、12和13 min。从图 7b可以看出, 与未饱和的细胞膜色谱柱相比, 降钙素在饱和细胞膜色谱柱中突破曲线的拐点时间均提前。这说明梓醇、齐墩果酸和丹皮酚占据了降钙素的结合位点, 导致降钙素在色谱柱中提前达到吸附饱和。其中, 细胞膜色谱被梓醇饱和后, 降钙素突破曲线的拐点最为提前。综上所述, 梓醇与成骨细胞膜的亲和强度最大。
成骨细胞是骨质疏松症的重要靶标细胞, 其增殖活性常用于评价药物的抗骨质疏松作用。本文选取成骨细胞, 考察3种浓度(0.1、1.0和10 μ mol/L)的梓醇、丹皮酚、齐墩果酸的体外药效学作用。如图 8所示, 这3种化合物在所有浓度范围内都能促进成骨细胞增殖, 其中又以梓醇的药效作用最强。
近年来, 斑马鱼作为药效筛选模型得到广泛应用, 斑马鱼骨骼的发育机制与哺乳动物高度同源, 泼尼松龙诱导的骨质疏松症斑马鱼模型已成为骨质疏松症研究的主要动物模型之一[20], 以头部骨矿化面积来评价药物的抗骨质疏松药效。本工作选取体外促成骨增殖活性最强的梓醇作为骨质疏松斑马鱼实验的研究对象。空白组、给药泼尼松龙骨质疏松模型组、梓醇给药组头部骨骼的显微镜照片见图 9。可以看出, 泼尼松龙处理后斑马鱼的头部骨矿化面积减少。经梓醇与泼尼松龙同时处理后, 斑马鱼的头部骨矿化面积较模型组增多。从图 9d可以看出, 骨质疏松模型组的骨矿化面积显著低于空白组(p＜0.01), 说明泼尼松龙(25 μ mol/L)能成功诱导斑马鱼骨量丢失, 成功建立了骨质疏松动物模型。梓醇给药组(25 μ mol/L)的骨矿化面积相对于骨质疏松模型组显著增加(p＜0.05), 说明梓醇具有较好的抗骨质疏松活性作用。结果与已有的其他骨质疏松模型实验结论一致[21], 进一步证明了梓醇是一种抗骨质疏松的活性成分。
六味地黄汤广泛用于治疗骨质疏松症, 临床疗效确切, 但其抗骨质疏松药效物质尚不明确。本文选取成骨细胞建立CMC/UPLC-TOF/MS, 筛选得到的梓醇、丹皮酚和齐墩果酸具有较好的抗骨质疏松活性, 有可能成为抗骨质疏松新药或先导化合物。本工作建立的药物筛选方法可快速、高效得到复杂中药方剂中的特殊活性成分, 方法可靠性较高, 能够为中药药效物质研究、中药产品质量控制，以及抗骨质疏松新药研发提供实验基础和技术手段。
2019,
Vol. 37 Issue (3): 305-312
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2019,
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