绿原酸(chlorogenic acid, CGA)广泛存在于蕨类植物到高等双子叶植物及相关的中成药中, 具有抗氧化、抗菌、抗病毒、消炎、降脂、护肝和神经保护等方面的功效[1]。CGA是众多中药及其制剂的质量控制指标之一, 因此建立CGA准确灵敏的定性定量分析方法至关重要。
目前定性及定量分析的常用方法是高效液相色谱法(HPLC), 但是考虑到中药及其相关产品成分复杂, 在HPLC分析之前有必要对样品进行预处理[2]。固相萃取因高富集因子、操作简便等优势被广泛使用, 反相C18、SiO2、金属氧化物、碳基吸附剂和聚合物吸附剂是常用的固相萃取吸附材料[3]。其中, 分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)具有构效预定性、特异识别性和广泛实用性等优势, 可用于复杂体系中目标组分的高效特异性分离富集, 并消除基质干扰[4-8]。迄今, 科研工作者在MIPs的合成和应用方面已做出了卓有成效的工作, 多数MIPs是在有机溶剂或非极性溶剂中, 氮气保护下, 通过模板分子与烯丙基功能单体(如甲基丙烯酸、丙烯酰胺、乙烯基咪唑等)及交联剂共聚而成, 合成的MIPs在非极性溶剂中具有良好的特异性识别性能[9]。同时表面印迹技术的应用也使印迹位点位于MIPs的表面, 增强吸附性能, 如已在磁性Fe3O4、中空纤维、纳米TiO2、石墨烯碳纳米管等表面成功地合成了基于CGA特异性吸附的MIPs[10-14]。但该类MIPs在水溶液中非特异性吸附强, 而常见的中药制剂、食品、生物制品等均是水溶液体系, 因此设计水体系中具特异性识别性能的MIPs势在必行。
为了提升MIPs的亲水性, 常用的策略是设计水溶性功能单体和交联剂, 或在MIPs表面接枝亲水性聚合物刷[15-17], 但这些方法合成步骤多、专业性强。因此, 开发一种简单、可靠、有效的方法合成亲水性MIPs很有必要。间苯二酚-甲醛、三聚氰胺-甲醛和间苯二酚-甲醛-三聚氰胺水溶液中加热可共聚成树脂, 同时该类树脂具有丰富的氨基、亚氨基、羟基等极性基团, 可通过氢键、静电作用识别水溶液中的化合物[18]。因此, 结合亲水性树脂和分子印迹技术的优点, 可制备出水体系中具特异性识别性能的亲水性分子印迹树脂(molecularly imprinted resins, MIRs)[18-23], 迄今关于表面MIRs的报道寥寥无几[22, 23]。基于CGA的亲水性MIPs合成及固相萃取性能已有较多研究[12, 24, 25], 但关于CGA的MIRs研究未见报道。
本文以CGA为模板、间苯二酚和三聚氰胺为双功能单体、甲醛为交联剂、磁性介孔二氧化硅(Fe3O4@mSiO2)为载体合成了亲水性磁性MIRs(magnetic MIRs, MMIRs)。优化了合成条件, 研究了MMIRs的静态、动态和选择性吸附性能, 并结合HPLC用于杜仲黑茶中CGA的选择性分离和含量检测。结果表明该方法简便、快速, 在水体系中的选择性识别性能好。
安捷伦1200高效液相色谱系统(在线脱气机、四元泵、恒温柱温箱、自动进样器和二极管阵列检测器) (Agilent Technologies, USA); Nicolet 6700傅里叶红外光谱仪(Thermo Nicolet Co., USA); JEM-2100F透射电子显微镜(JEOL, Japan); JC2000D1接触角测量仪(上海中晨数字技术设备有限公司, 上海); VSM7407振动样品磁强计(Lake Shore, USA); SDTQ600热重分析仪(TA, USA); Milli-Q超纯水仪(Bedford, USA)。
三聚氰胺、间苯二酚、甲醛、聚乙二醇6000(PEG 6000)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正硅酸四乙酯(TEOS)、氢氧化钠(NaOH)、三氯化铁(FeCl3·56H2O)、甲醇和乙醇均购自国药集团化学试剂有限公司(上海); HPLC级甲醇和乙酸购自西格玛奥德里奇贸易有限公司(上海); CGA、咖啡酸(caffeic acid, CA)、阿魏酸(ferulic acid, FA)、肉桂酸(cinnamic acid, CMA)对照品购自西亚试剂有限公司(山东)。
杜仲黑茶由张家界茶坤缘生物科技开发有限公司提供。
图 1为MMIRs的合成示意图。首先合成Fe3O4@mSiO2, 步骤同课题组前期研究[7]。接着将间苯二酚(3 mmol)和甲醛(6 mmol)溶于超纯水(30 mL), 40 ℃下磁力搅拌1 h形成A溶液; 将三聚氰胺(1 mmol)和甲醛(3 mmol)溶于超纯水(10 mL), 80 ℃下磁力搅拌至透明, 冷却至室温形成B溶液。然后将Fe3O4@mSiO2(100 mg)、A溶液、B溶液和CGA溶液(0.04 mol/L, 10 mL)混合, 80 ℃恒温机械搅拌反应3 h。磁分离Fe3O4@mSiO2/MIRs后, 水洗3次, 将其分散于NaOH水溶液(50 g/L, 20 mL)中搅拌除去mSiO2和CGA。最后, 磁分离MMIRs, 用水洗至中性, 40 ℃真空干燥至恒重。
亲水性磁性非分子印迹树脂(magnetic non-molecularly imprinted resins, MNIRs)的制备除了不加模板CGA外, 所有步骤同MMIRs的合成。
Waters SunFire-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m, Waters); 流动相为0.4% (v/v)乙酸(A)和甲醇(B), 梯度洗脱:0~10 min, 12%B; 10~16 min, 12%B~18%B; 16~25 min, 18%B; 柱温:25 ℃; 进样量:20 μ L; 流速:0.8 mL/min; 检测波长:254 nm。
吸附动力学:准确称取若干份MMIRs(MNIRs) (10.0 mg), 分别加入到CGA(1.4 g/L)的50%(v/v, 下同)乙醇水溶液(5.0 mL)中, 于25 ℃下200 r/min振荡吸附, 在不同的时间点(10~100 min)取出, 使用HPLC方法检测CGA的质量浓度Ct (g/L)。由方程(1)计算出MMIRs(MNIRs)对CGA的吸附量Qt (mg/g):
式中m (g)表示MMIRs(MNIRs)的质量, C0(g/L)和V(mL)分别是CGA溶液的初始浓度和体积。
静态吸附:准确称取若干份MMIRs(MNIRs) (10.0 mg), 分别加入到含不同质量浓度CGA(0.4~1.6 g/L)的50%乙醇溶液(5.0 mL)中, 于25 ℃下200 r/min振荡吸附70 min, 使用HPLC方法检测CGA的平衡浓度Ce (g/L)。由方程(2)计算出MMIRs(MNIRs)对CGA的平衡吸附量Qe (mg/g):
选择性吸附:选择模板分子CGA和3个结构类似物CA、FA和CMA, 准确称取4份MMIRs(MNIRs) (10.0 mg), 分别加入到含CGA、CA、FA和CMA的50%乙醇溶液中(1.4 g/L, 5.0 mL), 于25 ℃下200 r/min振荡吸附70 min, 使用HPLC方法检测平衡时CGA、CA、FA和CMA的质量浓度, 使用方程(2)计算平衡吸附量。
杜仲黑茶粉碎, 称取10.0 g杜仲黑茶粉末于100 ℃下用50%乙醇溶液(80.0 mL)回流提取3次, 每次提取2.0 h, 合并提取液后抽滤并减压浓缩至干燥, 得3.4 g浸膏。将MMIRs (20 mg)加入到杜仲黑茶的50%乙醇溶液中(3.0 g/L, 5 mL), 混合物在25 ℃下于200 r/min振荡吸附70 min, 磁分离MMIRs, 水洗3次除去非特异吸附成分, 然后用甲醇-水-醋酸(3 : 1 : 1, v/v/v, 5 mL)洗脱, 并用HPLC分析洗脱液。
MMIRs的合成过程中采用Fe3O4@mSiO2为载体, CGA、间苯二酚、三聚氰胺和甲醛在mSiO2的介孔中共聚生成MIRs, 无需对mSiO2表面进行官能团修饰, 最后通过NaOH刻蚀掉mSiO2和模板分子得到MMIRs。N2吸附和解吸附实验显示MMIRs的孔径为2.95 nm, 表明MMIRs具有多孔结构、印迹位点位于材料表面。模板分子CGA的加入量及印迹时间对MMIRs的印迹效果影响较大, 少量CGA导致识别位点少, 然而过量的CGA会和功能单体形成无序自组装; 共聚时间的增加会增厚印迹层, 从而导致印迹位点的包埋及吸附量的降低。实验中考察了不同CGA的加入量以及不同共聚时间对MMIRs吸附量的影响, 最终确定CGA的加入量为0.4 mmol, 共聚时间为3 h, 合成的MMIRs对CGA具有较好的吸附行为。
图 2为Fe3O4@mSiO2/MIRs和MMIRs的透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)图, Fe3O4@mSiO2/MIRs的平均粒径约200 nm, 其中壳层厚度30 nm左右[7]。除去mSiO2后, MMIRs呈现疏松多孔的核壳结构, 外部MIRs层薄约6 nm。Fe3O4、Fe3O4@mSiO2、Fe3O4@mSiO2/MIRs和MMIRs的红外光谱如图 3所示, 图 3a中576 cm-1为Fe-O强的伸缩振动峰, 图 3b中新增Si-O键在1 089和461 cm-1的振动峰, 在2 980 cm-1左右未见明显的C-H吸附峰, 表明CTAB的完全除去和Fe3O4@mSiO2的成功合成; 图 3c中, 宽而强的3 405 cm-1来自O-H和N-H的伸缩振动峰, 812 cm-1为N-H的面外弯曲振动, 1 346 cm-1和1 559 cm-1来自三聚氰胺中C-N的弯曲振动和伸缩振动, 1 160 cm-1是C-O-C的伸缩振动; 图 3d中, 未见1 089 cm-1和461 cm-1的吸收峰, 显示mSiO2的完全除去。结果表明MMIRs成功合成。
热重分析(图 4a)显示温度升高到800 ℃时质量损失60%, 源于MIRs层的分解; 磁滞回线(图 4b)显示MMIRs的磁饱和强度为40.6 emu/g, 实验中MMIRs在外加磁场的作用下5 s内可实现磁分离, 撤除外加磁场后能快速分散, 说明制备的MMIRs具有超顺磁性、高磁响应性的特点; 水滴与MMIRs接触2 s内迅速铺展, 接触角为4.50°(图 4c), 表明MMIRs具有极强的亲水性。因此, MMIRs可实现水体系中目标化合物的快速选择性分离。
MMIRs(MNIRs)对CGA的吸附动力学曲线如图 5a所示, 随着时间的延长吸附量逐渐增大, MMIRs在70 min时对CGA的吸附达到饱和, 而MNIRs在40 min时就趋于饱和吸附, MMIRs对CGA的吸附量远远大于MNIRs, 主要原因为MMIRs存在CGA的特异性吸附位点, 而MNIRs为表面分子间的氢键或静电作用。前期关于MIRs的合成报道中, 聚合时间为24 h左右, 平衡吸附时间为10~12 h[18-23]。因此, 表面多孔MIRs层结构以及适宜的MIRs层厚度可以使印迹位点位于表面, 加快吸附速率。
MMIRs(MNIRs)对CGA的静态吸附曲线如图 5b所示, 随着CGA质量浓度的增加吸附量逐渐增加, 在质量浓度大于1.4 g/L时吸附达到平衡, MMIRs对CGA的平衡吸附量(50.87 mg/g)是MNIRs平衡吸附量(9.71 mg/g)的5.24倍, 表明了MMIRs对CGA的特异性吸附。迄今, 文献报道的基于CGA的MIPs合成均为非水体系, 在乙腈等非质子性溶剂中具备选择性吸附性能[10-14]。本文合成了在水体系中具有高特异性吸附的印迹材料。
MMIRs(MNIRs)对CGA、CA、FA和CMA的平衡吸附结果如图 6所示, MMIRs对CGA的吸附容量(50.87 mg/g)是CA(12.05 mg/g)的4.22倍, FA(16.79 mg/g)的3.03倍, CMA(14.18 mg/g)的3.59倍; CGA、CA、FA和CMA在MNIRs上的吸附容量差异不大。结构的差异性会影响吸附能力, 说明印迹孔穴与CGA的互补性。
MMIRs对CGA吸附的稳定性至关重要, 合成了5批MMIRs, 其吸附量的RSD值为6.4%, 说明了批间的稳定性; 考察了10次连续吸附-解吸附的实验结果, 随着循环次数的增加, MMIRs对CGA的吸附能力轻微下降, 10次循环后吸附量为原先的91.5%, 表明MMIRs对CGA吸附的稳定性和重复利用性能。
配制系列CGA标准溶液, 使用MMIRs进行吸附-解吸附实验, HPLC分析检测CGA, 在2.0~200.0 mg/L范围内得到CGA的线性方程为Y=52.06X-19.92(R2=0.999 3), 其中Y和X分别是CGA的HPLC峰面积和质量浓度(mg/L)。CGA的检出限(信噪比S/N=3)为0.7 mg/L, 定量限(信噪比S/N=10)为1.6 mg/L。方法的加标回收率为93.1% ~109.4%, 相对标准偏差小于9.6%。说明该方法可满足CGA的测定要求。
将MMIRs-HPLC方法用于杜仲黑茶中CGA的测定, 图 7为杜仲黑茶经过MMIRs固相萃取前后的HPLC谱图, 经过MMIRs选择性固相萃取后, 基本不存在其他干扰性物质。最终, 测得杜仲黑茶中CGA的含量为(2.79±0.18) mg/g, 结果与文献[14]报道一致, 表明MMIRs选择性萃取分离结合HPLC分析检测可用于实际复杂体系中CGA的特异性分析。
本文以CGA为模板、间苯二酚和三聚氰胺为双功能单体、甲醛为交联剂、磁性介孔二氧化硅为载体合成了亲水性MMIRs。mSiO2的多孔结构提供了MIRs的聚合场所和多孔结构, 简化合成过程、增加吸附容量、加快吸附速率。MMIRs对CGA表现出良好的吸附选择性, 结合HPLC分析用于杜仲黑茶中CGA的测定, 排除复杂基质的干扰, 提高分析的准确度。MMIRs在水体系中的特异性吸附性能使其可作为新型吸附材料用于生物、环境和临床领域的研究中。
2019,
Vol. 37 Issue (3): 293-298
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