蛋白是生命科学领域最重要的研究对象, 参与多种生命过程中所必需的信号转导, 其功能通过与小分子、DNA、其他蛋白底物之间相互作用实现^{[1, 2]}。因此, 对蛋白的原位分析, 包括蛋白识别、蛋白分布及实时动态追踪等, 能够更真实地揭示蛋白在生理过程中发挥的作用。然而, 紫外吸收法、圆二色光谱法、电化学法、红外光谱法、核磁共振法等均很难实现活细胞及活体内蛋白的原位分析^[3]。

基于有机小分子的荧光分析法能够在不破坏原生环境下对蛋白进行监测。相比于传统基于荧光蛋白的分析法^[4-6], 有机小分子具有分子结构简单、颜色可选择多、易改造等优点, 因此其在蛋白识别、标记领域逐渐成为荧光蛋白的替代者^[7-10]。然而, 有机小分子染料通常源于人工合成, 无法像荧光蛋白一样由细胞内源产生。这就为小分子应用于蛋白原位分析中带来了诸多问题:如有机小分子荧光染料在细胞中分布不均匀, 易产生非特异性标记, 细胞毒性大等。其中, 有机小分子的非特异性标记问题尤为突出, 科研工作者无法像荧光蛋白分析法一样控制目标蛋白上连接有机小分子的数量及位置。因此, 这引发化学家去开发新的生物正交方法, 并基于生物正交的方式将小分子染料定点、共价连接到目标蛋白上, 进一步通过荧光信息跟踪、研究目标蛋白的位置和功能。目前应用最广泛的生物正交方式是基于酶促反应的蛋白标签技术, 如SNAP-tag、Halo-tag、PYP(Photoactive yellow protein)-tag等。SNAP-tag标签蛋白是人源DNA修复蛋白的O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(hAGT)的突变体^{[11, 12]}, 能够快速、特异性地与苄基鸟嘌呤(BG)或苄基氯嘧啶(CP)的衍生物反应, 进而使SNAP-tag蛋白与有机小分子之间形成稳定的硫醚键, 融合有SNAP-tag的目标蛋白能够特异性地连接一个探针分子。

目前, 基于SNAP-tag技术与小分子荧光染料已开发出多种商业的SNAP-tag荧光探针, 该类荧光探针通常由环境不敏感的荧光团(如:罗丹明、花菁染料、荧光素等)与苄基鸟嘌呤两部分构成。虽然, 这类探针与SNAP-tag标签蛋白能够达到很高的反应速率, 但是反应前后荧光信号变化通常较小(增强1~2倍)。因此, 这类探针在对细胞着色后存在较高的荧光背景, 需要多次洗涤以除去未反应或非特异性标记的分子, 才能达到高的信噪比。细胞的洗涤往往会造成时间分辨率的降低, 对于蛋白动力学分析带来不利。因此, 开发增强型的SNAP-tag荧光探针(即与SNAP-tag标签蛋白结合后荧光信号明显增强)显得尤为迫切。环境敏感型染料能够通过荧光信号的变化对分子周围环境微小改变进行快速、灵敏的响应(通常水中荧光量子产率很低), 因此这类染料逐渐被应用于SNAP-tag探针的设计中。通常这类探针由水环境中到SNAP-tag较为疏水的蛋白表面或空腔后, 荧光信号会明显增强, 从而达到免洗的效果^[13-15]。Tan课题组^[16-18]以环境敏感型染料(4-磺酰胺基-7-氨基苯并恶二唑, SBD)为发光基团, 设计合成了用于活细胞内免洗荧光成像的SNAP-tag探针BGSBD。与SNAP-tag结合后其荧光增强约280倍, 实现了活细胞内原位蛋白的荧光成像, 但是该探针的绝对亮度较低, 不能满足超分辨荧光成像需求。针对以上问题, 本研究基于传统的环境敏感型荧光染料萘酰亚胺, 结合SNAP-tag蛋白标记技术设计合成免洗的用于蛋白原位分析的荧光探针^[19-21]; 同时, 通过苄基鸟嘌呤的位置选择提高探针信噪比、选择性及反应速率, 以满足不同实验方案及领域对识别与标记效果的要求。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

核磁共振氢谱(¹H NMR)在Bruker (AVANCE Ⅲ 400/101MHz)波谱仪上测试得到, 其中以0.03%(v/v)的四甲基硅烷作为基准物质。紫外/可见吸收光谱与荧光发射光谱分别在Agilent Cary 60 UV-Vis分光光度计及Agilent CARY Eclipse荧光光谱仪上测得。溶剂pH在Sartorius PB-10的pH计上测得。生物细胞成像则在Olympus FV1000激光共聚焦显微镜上测得, 其中镜头选取100倍油镜(NA=1.40)。

分子合成所使用试剂为国产(伊诺凯公司和百灵威公司)或进口(Sigma-Aldrich公司)试剂, 未经特殊说明外, 均为分析纯, 直接使用。商业化染料细胞核染料Hoechst 33342与线粒体商业染料MitoTracker Red均购自凯基生物公司。柱色谱分离纯化用硅胶粉型号为200~300目(伊诺凯公司)。生物测试用商业化亚细胞器标记染料(美国Life Technologies公司)。生物细胞培养所需的DMEM及1640培养基、青链霉素(美国Hyclone公司); 优质胎牛血清(以色列Biological Industries)。

1.2 探针合成

1.2.1 探针BGAN-Amino的合成

依次称取4-氨基-N-(4-(O-2-氨基嘌呤)基甲基)苄基-1, 8-萘酰亚胺(AN-Amino) (30 mg, 0.09 mmol)、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯氨基嘌呤氯盐(BG⁺) (81 mg, 0.27 mmol)和叔丁醇钾(70 mg, 0.54 mmol)溶于5 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中, 在氮气氛围保护下室温搅拌10 h后停止反应(见图 1)。减压除去DMF, 粗产物经硅胶柱分离纯化(洗脱剂为二氯甲烷-甲醇, 15:1, v/v), 通过薄层色谱板监测产物流出, 所得产物减压除去溶剂得黄色粉末26 mg, 产率62%。

图 1

Fig. 1

图 1 探针BGAN-Amino的合成 Fig. 1 Synthesis of BGAN-Amino t-BuOK: potassium tert-butoxide; DMF: N, N-dimethylformamide.

1.2.2 探针mBGAN-2C的合成

依次称取4-乙氨基-N-(3-(O-2-氨基嘌呤)基甲基)苄基-1, 8-萘酰亚胺(mAN-2C)(50 mg, 0.14 mmol)、BG⁺(105 mg, 0.41 mmol)和叔丁醇钾(90 mg, 0.80 mmol)溶于5 mL干燥的DMF中, 在氮气氛围保护下室温搅拌3 h后停止反应(见图 2)。减压除去DMF, 粗产物经硅胶柱(200~300目)分离纯化(洗脱剂为二氯甲烷-甲醇, 20:1, v/v), 通过薄层色谱板监测产物流出, 所得产物减压除去溶剂得黄色粉末33 mg, 产率48%。

图 2

Fig. 2

图 2 探针mBGAN-2C的合成 Fig. 2 Synthesis of mBGAN-2C

1.2.3 探针4BGAN-Bu的合成

依次称取4-(4-(O-2-氨基嘌呤)基甲基)苄基-N-丁基-1, 8-萘酰亚胺(4AN-Bu)(100 mg, 0.26 mmol)、BG⁺(197 mg, 0.77 mmol)和叔丁醇钾(175 mg, 1.56 mmol)溶于5 mL干燥的DMF中, 在氮气氛围保护下室温搅拌10 h后停止反应(见图 3)。减压除去DMF, 粗产物经硅胶柱分离纯化(洗脱剂为二氯甲烷-甲醇, 15:1, v/v), 通过薄层色谱板监测产物流出, 所得产物减压除去溶剂得到黄色粉末26 mg, 产率19%。

图 3

Fig. 3

图 3 探针4BGAN-Bu的合成 Fig. 3 Synthesis of 4BGAN-Bu

1.3 探针的紫外吸收与荧光发射光谱测试

准确称取待测探针化合物溶于色谱纯二甲基亚砜(DMSO)溶液中配制成2 mmol/L测试母液。准确量取一定体积的母液加入到测试体系中以配制成所需测试浓度(1~10 μmol/L)(其中DMSO所占体积分数小于0.5%)进行吸收与荧光发射光谱的测定。

分别取2.5 μL探针母液加入1 mL磷酸缓冲液中(PBS, 20 mmol/L, pH 7.4)配制为5 μmol/L的测试液进行吸收及荧光发射光谱测试, DMSO含量为0.25%(v/v); 而后向上述测试液中分别加入20 μL SNAP-tag蛋白溶液(250 μmol/L的PBS溶液, 20 mmol/L, pH 7.4)并反应30 min后进行吸收及荧光发射光谱测试。以上荧光光谱采集均选用440 nm激发, 狭缝为5-5;控制测试温度为37 ℃。

1.4 细胞培养及其荧光成像

细胞选用DMEM培养基(其中加入青霉素或者链霉素和10%胎牛血清(FBS))进行培育。对对数期HeLa细胞进行消化处理后接种于共聚焦专用皿(MatTek, 半径20 mm)中, 于37 ℃、5% CO₂下孵育24~48 h。而后将所需质粒与Lip3000分别加入无血清培养基中, 混合5~10 min后加入细胞培养皿, 继续孵育24~48 h后, 取适量待测化合物母液加入培养基中(根据需要选择合适终浓度)置于共聚焦荧光显微镜下观察(镜头选用100倍油镜)。激光为405 nm, 荧光采集为420~470 nm; 激光为488 nm, 荧光采集为500~550 nm; 激光为561 nm, 荧光采集为580~653 nm。

2 结果与讨论

2.1 探针的核磁共振表征

探针BGAN-Amino核磁氢谱数据为:¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.41 (s, 1H), 8.64 (d, J=8.3 Hz, 1H), 8.45 (d, J=6.8 Hz, de 1H), 8.22 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.70~7.61 (m, 1H), 7.51 (s, 2H), 7.43 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.34 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.86 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.27 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.23 (s, 2H)。

探针mBGAN-2C核磁氢谱数据为:¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.42 (s, 1H), 8.69 (t, J=15.8 Hz, 1H), 8.44 (d, J=7.2 Hz, 1H), 8.25 (dd, J=28.3, 8.6 Hz, 1H), 7.78 (t, J=16.4 Hz, 2H), 7.66 (dd, J=17.9, 9.8 Hz, 1H), 7.45 (d, J=27.3 Hz, 1H), 7.32 (dt, J=16.0, 7.8 Hz, 2H), 6.77 (d, J=8.7 Hz, 1H), 6.28 (s, 2H), 5.44 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 3.43 (dd, J=11.6, 5.9 Hz, 2H), 1.39~1.21 (m, 3H)。

探针4BGAN-Bu核磁氢谱数据为:¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.42 (s, 1H), 8.78 (d, J=8.3 Hz, 1H), 8.52~8.46 (m, 1H), 8.46 (d, J=7.2 Hz, 1H), 8.18 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.76~7.67 (m, 1H), 7.49 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.43 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.67 (d, J=8.6 Hz, 1H), 6.27 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 4.68 (d, J=5.8 Hz, 2H), 4.05~3.96 (m, 2H), 1.57 (dt, J=14.8, 7.5 Hz, 2H), 1.35~1.27 (m, 2H), 0.91 (t, J=7.3 Hz, 3H)。

经检测, 以上核磁数据与各探针结构相符, 探针结构正确。

2.2 探针对SNAP-tag标签蛋白的荧光响应

基于环境敏感的萘酰亚胺荧光团, 在萘酰亚胺母体不同位置引入苄基鸟嘌呤基团, 有望得到与SNAP-tag结合效果不同的荧光探针。通过萘酰亚胺内酰胺引入苄基鸟嘌呤基团, 并调节嘌呤在苯环的取代位置得到BGAN-Amino与mBGAN-2C;在萘酰亚胺4-位引入苄基鸟嘌呤基团得到探针4BGAN-Bu。终浓度为5 μmol/L的BGAN-Amino、mBGAN-2C、4BGAN-Bu分别与5 μmol/L SNAP-tag蛋白结合后荧光信号均得到了增强, 但增强倍数不一(见图 4)。BGAN-Amino与SNAP-tag结合后荧光强度增强约9倍, 而mBGAN-2C、4BGAN-Bu分别只有2倍与3倍。探针荧光强度的增加主要来源于SNAP-tag标签蛋白表面的疏水作用与荧光淬灭基团鸟嘌呤的离去; 荧光波长的变化源于探针由水环境(20 mmol/L PBS, pH 7.4)到SNAP-tag标签蛋白疏水空腔的变化。相比于BGAN-Amino, mBGAN-2C与4BGAN-Bu荧光增强倍数少的原因为二者在PBS(磷酸缓冲液, 20 mmol/L, pH 7.4)中荧光强度高, 即荧光背景强。以上数据说明本论文中的探针与SNAP-tag标签蛋白结合后, 蛋白空腔或表面的疏水作用给萘酰亚胺母体带来了较好的荧光增强效果, 其能够作为免洗的SNAP-tag探针用于生物原位成像及蛋白的原位分析中。4BGAN-Bu探针具有较好的细胞相容性及染色速度, 因此该探针被进一步用于活细胞内蛋白的原位分析及荧光成像。

图 4

Fig. 4

图 4 不同SNAP-tag探针与蛋白结合前后的荧光谱图 Fig. 4 Fluorescence spectra of different probes in the absence and presence of SNAP-tag

2.3 探针4BGAN-Bu在活细胞内对细胞核内H2B蛋白的原位监测

在体外4BGAN-Bu能够对SNAP-rag蛋白进行特异性识别, 且荧光得到明显增强, 但其能否应对复杂生物环境中特异标记目标蛋白仍需进一步考究。首先, 对HeLa细胞进行瞬时转染以表达融合有SNAP-tag的核内蛋白H2B。终浓度1 μmol/L的4BGAN-Bu细胞培养液在37 ℃孵育HeLa细胞30 min后通过共聚焦荧光显微镜对目标蛋白进行荧光分析。图 5a表明4BGAN-Bu能对细胞核内融合有SNAP-tag的H2B蛋白进行染色, 细胞核轮廓清晰, 无需洗涤细胞。4BGAN-Bu标记的H2B蛋白与商品化Hoechst 33342标记的DNA结构能够很好重合(见图 5b、5c), 这间接证明了H2B蛋白存在染色体内并与DNA双链有较强结合。此外, 图 5d中对细胞内荧光强度分析表明, 4BGAN-Bu对H2B染色的信噪比较高, 具有很好的免洗荧光成像效果。

图 5

Fig. 5

图 5 HeLa细胞的共聚焦成像图 Fig. 5 Confocal images of HeLa cells a. Live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu; b. Live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with commercial dye Hoechst 33342; c. Live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu and Hoechst 33342; d. Intensity profile of regions of interest (ROI) across HeLa cells.

2.4 探针4BGAN-Bu在活细胞内对线粒体中Cox8A(细胞色素C氧化酶)的原位监测

细胞色素C氧化酶是线粒体内电子传递链中的末端酶, 其动态分布、功能的行使与细胞的代谢密切相关。然而, 由于时间分辨与空间分辨率的限制, 质谱、圆二色光谱等分析手段在原位监测细胞色素C氧化酶的动态行为上存在较大困难。而通过转染融合有SNAP-tag蛋白的Cox8A, 可以借助探针4BGAN-Bu达到对Cox8A的实时跟踪。图 6a中标记有4BGAN-Bu的Cox8A在线粒体中分布均匀, 线粒体清晰可见且呈线条型(见图 6b)。图 6c-e表明, 4BGAN-Bu与商业线粒体染料能够实现共定位, 且SNAP-tag结合后有较高信噪比。4BGAN-Bu能够在染色后直接用于对Cox8A的原位监测, 避免反复洗涤细胞过程中对细胞的细微损伤。

图 6

Fig. 6

图 6 HeLa细胞的共聚焦成像图 Fig. 6 Confocal images of HeLa cells a, b. live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu; c. live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with commercial dye MitoTracker Red; d. live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu and MitoTracker Red; e. intensity profile of regions of interest (ROI) across HeLa cells.

2.5 线粒体损伤过程中探针4BGAN-Bu对Cox8A(细胞色素C氧化酶)的原位监测

借助探针4BGAN-Bu的免洗及高特异性, 进一步考察了线粒体受到损伤后线粒体形态变化及Cox8A分布变化(见图 7a)。高强度激光照射后, 线粒体逐渐由线型(见图 6b)变为棒状或圆形(见图 7b), 而Cox8A仍然精准定位线粒体内。实验表明, 借助有机小分子探针4BGAN-Bu与SNAP-tag融合蛋白可以实现对活细胞内不同状态下的细胞色素C氧化酶Cox8A的实时监测。

图 7

Fig. 7

图 7 损伤的HeLa细胞的共聚焦成像图 Fig. 7 Confocal images of injured HeLa cells a, b. live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu; c. live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with commercial dye MitoTracker Red; d. live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu and MitoTracker Red.

3 结论

本研究通过对苄基鸟嘌呤基团连接位置的改造设计了一系列基于萘酰亚胺的SNAP-tag探针, 达到了对SNAP-tag不同的识别效果。该系列探针对融合有SNAP-tag的目标蛋白进行了特异性识别, 其中BGAN-Amino与SNAP-tag结合后荧光增强了9倍, 4BGAN-Bu具有较高反应速率。此外, 此系列SNAP-tag探针能够针对目标蛋白实现活细胞内的免洗荧光成像, 对原位分析目标蛋白的动态变化及功能的行使具有重要意义。

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