玉米赤霉酮纯度标准物质杂质定性鉴定与主成分定量分析


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	冯梦雨

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	国振

	李秀琴

	张庆合

冯梦雨¹, 刘栓^1,2, 高燕¹, 周澍堃¹, 国振¹, 李秀琴¹, 张庆合¹

1. 中国计量科学研究院, 北京 100029;
2. 北京化工大学, 北京 100029

收稿日期：2019-04-15

基金项目：国家重点研发计划"战略性国际科技创新合作重点专项"（2016YFE0206500）

通讯联系人：李秀琴, Tel:(010)64524784, E-mail:lixq@nim.ac.cn

摘要：建立了高纯玉米赤霉酮中痕量杂质的液相色谱分离分析方法，进行了标准物质纯度的定量分析。采用超高效液相色谱-二极管阵列检测法（UPLC-DAD）和UPLC-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术（UPLC-HRMS）鉴定了玉米赤霉酮原料中3种主要有机杂质（β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉醇和脱水玉米赤霉醇）；计算了3种杂质的相对响应因子（0.5352、0.8594和0.6973）。基于UPLC-DAD，采用校准因子归一化方法对玉米赤霉酮原料中主成分进行测定，标准物质纯度为99.6%，测量标准偏差为0.01%。该方法可为玉米赤霉酮标准物质的研制提供技术支撑。

关键词：超高效液相色谱-二极管阵列检测高分辨质谱定性鉴定标准物质玉米赤霉酮

Qualitative identification of impurities and principal component quantitative analysis of zearalanone on purity certified reference material

FENG Mengyu¹, LIU Shuan^1,2, GAO Yan¹, ZHOU Shukun¹, GUO Zhen¹, LI Xiuqin¹, ZHANG Qinghe¹

1. National Institute of Metrology, Beijing 100029, China;
2. Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China

Foundation item: National Key Research and Development Program of China "Strategic Key Program for International Science and Technology Innovation Cooperation Projects" (No. 2016YFE0206500)

Abstract: A liquid chromatography method was established for the determination of zearalanone (ZAN) raw material. The qualitative analysis of ZAN and its trace impurities was performed by ultra performance liquid chromatography-diode array detector (UPLC-DAD) and ultra performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS), and the response factors of each impurity were calculated. The three main organic impurities in the ZAN raw material were identified as β -zearalanol, α -zearalanol and a dehydration product of zearalanol with relative response factors of 0.5352, 0.8594 and 0.6973, respectively. The main component of the ZAN raw material was determined by the calibration factor normalization method. The purity of zearalanone was determined to be 99.6% with a standard deviation of 0.01%. This method can provide a technical support for the development of ZAN standard materials.

Key words: ultra performance liquid chromatography-diode array detection (UPLC-DAD) high resolution mass spectrometry (HRMS) impurity identification certified reference material zearalanone (ZAN)

玉米赤霉酮(zearalanone, ZAN)为玉米赤霉烯酮经过多次转化得到的降解产物, 是一种白色结晶, CAS号为5975-78-0, 化合物的结构式见图 1。玉米赤霉酮具有弱雌激素效应, 通过食物链进入人体后, 可引起人体功能发生紊乱, 甚至影响生育^{[1, 2]}。目前国内外还没有玉米赤霉酮的限量标准, 国家标准方法^[3-6]中规定，测定动物源食品(牛猪肝肾、肌肉组织、牛奶和鸡蛋等)和水产品(河豚、鳗鱼、烤鳗)中玉米赤霉酮残留量均采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。目前已建立了各种分析玉米赤霉酮的方法, 包括高效液相色谱法(HPLC)^[7]、气相色谱-质谱法(GC-MS)^{[8, 14]}、液相色谱-质谱法(LC-MS)^[9]和液相色谱-串联质谱法^[10-12]。质谱仪器因其高灵敏度和准确性已经越来越多的应用于玉米赤霉酮等的研究。Li等^[13]改进了一种基于UPLC-MS/MS的96孔微洗脱固相萃取方法, 并运用这种方法对玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮及其他代谢产物进行了高通量及高灵敏度的测定。Qian等^[14]开发了凝胶渗透色谱法和气相色谱-三重四极杆质谱法(GC-QqQ MS)同时测定食用植物油中的玉米赤霉酮等。采用双波长荧光偏振免疫分析(DWFPIA)^[15]检测玉米中总黄曲霉毒素和玉米赤霉酮, 用不同的荧光素标记黄曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉酮, 通过结合特异性抗体，开发DWFPIA方法筛选天然污染的样品, 取得了和HPLC-MS/MS相似的结果。然而目前国内外还没有玉米赤霉酮纯度标准物质, 在国际标准物质数据库(COMAR)和国家标准物质资源共享平台均未查到玉米赤霉酮标准物质及其溶液标准物质的相关信息。因此开展玉米赤霉酮标准物质的研制工作是十分必要的, 以保障玉米赤霉酮相关检测结果的准确、可靠。

图 1 玉米赤霉酮的结构式 Fig. 1 Structural formula of zearalanone (ZAN)

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱-串联Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(UPLC-HRMS, 美国Thermo Fisher Scientific公司); Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国Agilent公司); ME235S(0.01 mg)、ME36S电子天平(0.001 mg)(德国Sartorius公司)。

玉米赤霉酮(纯度≥99.0%)、玉米赤霉烯酮(纯度≥99.5%)、α-玉米赤霉醇(纯度≥97%)、β-玉米赤霉醇(纯度≥98%)、α-玉米赤霉烯醇乙腈溶液(104.8 mg/L)、β-玉米赤霉烯醇乙腈溶液(99.3 mg/L)、7-脱氢玉米赤霉烯酮(纯度≥90%)均购自天津阿尔塔科技有限公司。乙腈、甲酸(色谱纯)购自美国Thermo Fisher Scientific公司; 水(色谱纯)购自德国Merck公司。

分别取适量玉米赤霉酮样品, 配制成质量浓度为0.1 g/L和0.5 g/L的玉米赤霉酮乙腈溶液。置于-20 ℃冰箱中保存。本研究中所使用的标准溶液均采用重量法配制, 乙腈为溶剂。

1.2 定性分析方法

采用紫外检测法和质谱法对玉米赤霉酮主成分进行定性分析, 并采用UPLC-DAD和高分辨质谱对ZAN原料中所含痕量杂质进行定性鉴定。

1.2.1 UPLC-DAD方法

色谱柱:Phenomenex Kinetex EVO C₁₈柱(250 mm×4.6 mm, 2.6 μm); 柱温:27 ℃; 流动相:A相为乙腈-水(40:60, v/v)(含0.1%(v/v)甲酸)混合溶液, B相为0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液; 流速:1.5 mL/min。梯度洗脱条件:0~15 min, 100%A; 15~16 min, 100%A~10%A; 16~18 min, 10%A; 18~19 min, 10%A~100%A; 19~25 min, 100%A。, 进样量:10 μL(0.5 g/L玉米赤霉酮乙腈溶液); 检测波长:264 nm。

1.2.2 UPLC-HRMS方法

采用高分辨质谱的一级质谱全扫描加数据依赖的二级质谱扫描方式(Full MS/dd-MS²), 分析时采用正负离子切换方式。

一级质谱参数:离子源为电喷雾电离源; 扫描范围为m/z 200~800;分辨率为70000 FWHM(一个峰半峰高处的全峰宽); 自动增益控制目标离子数(AGC target)为1×10⁶。

dd-MS²参数:分辨率为17500 FWHM; 归一化碰撞能量(NCE)为30 eV; 动态排除时间为10.0 s; AGC target为1×10⁵。为避免污染仪器, 主成分不进入质谱。

1.3 主成分定量分析

购买杂质对照品, 采用已建立的UPLC-DAD方法, 测量杂质的响应因子；无对照品杂质的响应因子采用其他杂质响应因子的平均值代替。最后采用响应因子校正面积归一化法对玉米赤霉酮主成分进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱分析条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

目前国内外HPLC测定真菌毒素的文献^[16-18]中, 最常用的色谱柱为含C18官能团的色谱柱, 主要是因为C18固定相有较高的含碳量和更好的疏水性, 柱稳定性高, 寿命长, 平衡速度、分析速度快, 重现性好, 对真菌毒素具有很好的分离效果。本实验考察了3种C18反相色谱柱, 分别为色谱柱1 ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、色谱柱2 Kinetex EVO C18柱(150 mm×3.0 mm, 2.6 μm)和色谱柱3 Phenomenex Kinetex EVO C18柱(250 mm×4.6 mm, 2.6 μm)。实验以乙腈-水(40:60, v/v)为流动相等度洗脱20 min, 结果显示, 在3种色谱柱上样品的峰形与分离效果均较好, 能分离出的杂质数目相同, 各个峰的分离度均大于1.5, 其中采用色谱柱3时，分离出的4个色谱峰的分离度分别为13.37、13.67和13.64, 分离度最好。因此本研究选择分离度最好的Phenomenex Kinetex EVO C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 2.6 μm)进行分析。

2.1.2 流动相组成

考察了不同比例的水和乙腈作为流动相进行等度洗脱和梯度洗脱时主成分与杂质的出峰情况, 结果见图 2。由图 2可知, 在水-乙腈(50:50, v/v)(流动相a)条件下等度洗脱, 分离出3种杂质, 基线较平稳, 各杂质之间及与主峰之间能基本分离, 但主峰有拖尾现象(拖尾因子(T)=1.32)。在水-乙腈(60:40, v/v)(流动相b)初始条件下梯度洗脱, 仅分离出的2种杂质, 各杂质之间与主峰之间均能完全分离, 但所有峰均有严重拖尾现象, 3个峰的拖尾因子分别为2.01、1.79和2.1。以乙腈-水(40:60, v/v)(含0.1%(v/v)甲酸)混合溶液为A相、0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液为B相(流动相c)进行梯度洗脱，可分离出4种杂质, 而且峰与峰之间的分离度均大于1.5, 色谱峰对称性较好。因此, 综合考虑分离杂质数量和峰形, 选择流动相c作为最佳流动相条件。

图 2 采用不同流动相时玉米赤霉酮原料的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of ZAN raw material using the different mobile phases a. mobile phase: water and acetonitrile (50:50, v/v), isocratic elution; b. mobile phase: water (A) and acetonitrile (B), gradient elution: 0~23 min, 60%A; 23~24 min, 60%A~10%A; 24~26 min, 10%A; 26~27 min, 10%A~60%A; 27~35 min, 60%A; c. mobile phase: acetonitrile-water (40:60, v/v) containing with 0.1% (v/v) formic acid (A) and acetonitrile containing with 0.1% (v/v) formic acid (B), gradient elution: 0~23 min, 100%A; 23~24 min, 100%A~10%A; 24~26 min, 10%A; 26~27 min, 10%A~100%A; 27~35 min, 100%A. Peaks 1-4 were the impurities 1-4..

为确证该流动相条件下能够将原料中所有的非极性杂质完全洗脱, 在最优流动相洗脱结束后, 再以乙腈-水(90:10, v/v)洗脱60 min, 结果表明主成分出峰之后并无杂质被洗脱出来, 因此后续不采用乙腈-水(90:10, v/v)继续洗脱。

2.1.3 流动相流速

考察了1.0 mL/min和1.5 mL/min不同流速下玉米赤霉酮原料的分离情况。结果显示, 两者分离出的杂质数目相同, 且峰与峰之间的分离度均大于1.5。增加流速, 可缩短分析时间, 因此选用1.5 mL/min的流速。

2.1.4 样品浓度的选择

考察了0.1、0.5、1.0 g/L的样品进样时的分离情况。结果显示, 不同的样品浓度, 分离结果没有差别。为了节省样品、减少污染, 采用0.1 g/L样品溶液进行定量分析, 0.5 g/L样品溶液进行定性分析。

2.1.5 检测波长的选取

对玉米赤霉酮原料在190 nm~400 nm波长下扫描, 发现玉米赤霉酮的3个最大吸收波长分别为216、264和302 nm; 杂质1的最大吸收波长为262 nm, 杂质3的为216 nm和264 nm, 杂质4的为256 nm。综合考虑主成分和杂质的响应, 选用264 nm作为检测波长。

2.2 定性分析

2.2.1 主成分定性分析

从玉米赤霉酮原料的质谱图可得出其主成分([M-H]^-)的相对分子质量为319.2, 与玉米赤霉酮的相对分子质量(320.380)相符合, 另外两个特征碎片离子的m/z 275.3、205.2均与文献报道^{[19, 20]}一致。根据玉米赤霉酮的裂解规律, 推测玉米赤霉酮的裂解途径见图 3, 其酯基断裂, 脱去一个CO₂分子, 产生离子[M-H-CO₂]^-, 该离子进一步脱去一个C₅H₁₀分子得到[M-H-CO₂-C₅H₁₀]^-, 两个离子的质荷比与上述两个特征碎片离子的质荷比一致, 可以证明此样品为玉米赤霉酮。

图 3 负离子模式下玉米赤霉酮的裂解途径 Fig. 3 Fragmentation pathway of the ZAN in negative ion mode

2.2.2 杂质定性分析

采用UPLC-DAD对玉米赤霉酮原料进行分析, 得到其主成分及杂质成分的典型色谱图(见图 4)。根据面积归一化法可知, 杂质1~4的含量分别为0.018%、＜0.01%、0.287%和0.19%。根据ZAN可能的代谢降解路径, 推测样品中可能含有玉米赤霉醇、玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮等。根据保留时间进行初步鉴定, 杂质1为β-玉米赤霉醇, 杂质3为α-玉米赤霉醇。

图 4 玉米赤霉酮乙腈溶液(0.5 g/L)、乙腈、α-玉米赤霉醇(0.1 g/L)和β-玉米赤霉醇(0.1 g/L)的典型色谱图 Fig. 4 Typical chromatograms of ZAN acetonitrile solution (0.5 g/L), acetonitrile, α-ZAN (0.1 g/L) and β-ZAN (0.1 g/L) Peaks 1-4 were the impurities 1-4.

采用UPLC-HRMS的Full mass dd-MS²模式对ZAN原料中的3种主要杂质进行质谱鉴定。由图 5可知, 杂质1母离子([M-H]^-)的m/z为321.17111与β-玉米赤霉醇母离子的m/z 321.17114一致, 质谱图也完全一致, 确证该杂质为β-玉米赤霉醇; 杂质3母离子([M-H]^-)的m/z为321.17120与α-玉米赤霉醇母离子的m/z 321.17203一致, 质谱图也完全一致, 确证该杂质为α-玉米赤霉醇。α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇为同分异构体, 它们的主要质谱碎片的裂解途径见图 6a, m/z为303.16092的主要碎片为玉米赤霉醇7位C上的羟基与6位C上的氢作用脱去一个H₂O分子, 而产生的离子[M-H-H₂O]^-, 该分子进一步脱去一个CO₂产生m/z为259.17072的离子; 另一m/z为277.18124的主要碎片为玉米赤霉醇的酯基脱去一个CO₂分子产生。

图 5 杂质1、3与其对照品和杂质4的二级质谱图 Fig. 5 MS² spectra of impurities 1, 3 and their standards, and impurity 4

由图 5可知, 杂质4母离子的m/z为303.16074, 软件推测杂质4的分子式为C₁₈H₂₄O₄, 可以得知该化合物母离子与玉米赤霉醇母离子(m/z 321.17111)的分子量相差18, 推测该化合物为玉米赤霉醇的脱水降解产物, 其结构为玉米赤霉醇7位羟基脱掉一个H₂O分子, 在6位C和7位C之间形成一个烯键。根据该杂质的进一步质谱碎片, 推测其裂解途径如图 6b所示, 主要碎片(m/z 259.17068)为脱水玉米赤霉醇的酯基脱去一个CO₂分子, 该分子进一步脱去一个C₂H₄分子产生m/z为231.13852的碎片, 其脱去一个C₂H₂分子得到m/z为205.12312的碎片离子。但是, 目前无法购买到脱水玉米赤霉醇的对照品, 不能进行验证。

图 6 负离子模式下(a)杂质1、杂质3和(b)杂质4可能的裂解途径 Fig. 6 Proposed fragmentation pathways of (a) impurity 1 or impurity 3 and (b) impurity 4 in negative ion mode

2.3 定量分析

2.3.1 杂质响应因子的测定

2015版中国药典^[21]中规定测定杂质含量时, 可采用加校正因子的主成分自身对照法, 通常以主成分为参比, 且需将供试品溶液稀释作为对照溶液; 杂质含量低于0.5%的峰面积的RSD应小于10%。赵敬丹等^[22]比较了外标法和加校正因子的主成分自身对照法测定头孢孟多酯钠中的杂质, 结果基本一致。因此在没有杂质对照品的情况下, 均应采用加校正因子的主成分自身对照法定量, 增加测定结果的准确度, 也无需持续提供杂质对照品。刘光敏^[23]采用标准曲线法和加校正因子的主成分自身对照法测定非那雄胺片中2种有关物质含量, 测定结果也基本一致。采用相对校正因子法适用于快速检测, 现场检测^[24]。

采用单点法测量, 根据公式(1)和(2)计算杂质和主成分相应进样量下的响应因子和相对响应因子。对于没有对照品的杂质4，用杂质1和3两个已知杂质响应因子的平均值作为其相对响应因子。公式(1)和(2)如下所示：

(1)

(2)

式中, f_i和f_m:杂质组分和主成分的响应因子, mAU×min/ng; A_i和A_m:杂质组分和主成分的色谱峰面积, mAU×min; C_i和C_m:杂质组分和主成分进样的质量浓度, g/L; V_i和V_m:杂质组分和主成分的进样体积, μL; F_i:各杂质相对主成分的相对校正因子。

根据公式计算得到杂质1、3和主成分的响应因子分别为0.7454、1.1969和1.3928 mAU×min/ng。使用主成分响应因子校正后得到杂质1和3的相对校正因子为0.5352和0.8594, 杂质4的相对校正因子取这两者的平均值, 为0.6973。3个杂质的相对响应因子均不在0.9~1.1之间, 因此可采用“加校正因子的主成分自身对照法”计算杂质的含量^[25-27]。

2.3.2 主成分纯度定量分析

由于仪器响应的线性限制, 峰面积归一化法一般不宜用于微量杂质的检査。因此采用校正后的峰面积归一化法来测定主成分纯度, 公式(3)如下所示:

(3)

式中, P_o为主成分纯度。

采用UPLC-DAD法测定主成分纯度。称取11份玉米赤霉酮原料约1 mg，配制成0.5 g/L的乙腈溶液，进样分析。按公式(3)计算，采用相对校正因子校正后，杂质1的含量小于0.01%, 杂质3和杂质4的含量分别为0.2%和0.1%。最终得到玉米赤霉酮主成分的纯度为99.6%, 标准偏差为0.01%。

3 结论

研究建立了玉米赤霉酮的纯度定量以及结构类似物杂质的定性和定量分析方法。针对高纯标准物质研制中微痕量杂质的定性鉴别和分析难点和关键点, 通过采用UPLC-DAD和UPLC-HRMS技术成功鉴定了玉米赤霉酮中的3种杂质。该方法可为玉米赤霉酮标准物质的研制提供理论支持。

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