全血直接离心得到的人血清中存在蛋白质、脂质、肽段等多种组分^{[1, 2]}, 是一种极其重要的生物样品, 广泛用于疾病的检测与诊断。其中, 内源性肽段参与了许多重要的生理病理进程^[3], 是寻找疾病标记物的重要来源。目前, 质谱是鉴定内源性肽段的主要方法, 但由于血清成分复杂, 在鉴定中容易受到其他物质的干扰。因此, 在进行质谱分析前, 对人血清进行高效、高选择性的预富集十分重要。目前, 多种预富集方法已被用于人血清中内源性肽段的富集, 如溶剂沉淀法^{[4, 5]}、离心超滤法^[6]、固相萃取法^[7-9]等。

基于金属有机框架(MOFs)的固相萃取材料具有MOFs材料有序的孔道、比表面积大和尺寸排阻效应的特点, 可以从复杂的生物样品中富集低丰度的小分子肽段, 同时排阻相对分子质量较高的蛋白质, 因此被广泛应用于高效分离富集多肽^[10-14]。Zhao等^[15]合成了一种表面修饰Zr-MOFs的磁性纳米材料Fe₃O₄@PDA@Zr-MOF, 并将其应用于磷酸化肽段的富集。Xiong等^[16]采用层层自组装法制备得到了磁性介孔材料Fe₃O₄@MIL-100(Fe), 并将其应用于人血清中内源性肽的富集。金属框架有机物高温煅烧得到的介孔碳材料, 具有高度有序结构、化学惰性及强疏水性的优点, 是一种良好的富集肽段的材料^{[17, 18]}。Sun等^[19]以MOFs材料Co-ZIF-67为牺牲模板, 合成了一种磁性纳米多孔碳材料(NPC)。该材料具有强磁性、高比表面积、有序的介孔结构以及高含碳量的特点, 可以高效地富集生物样品中的N-糖链。Li等^[20]等高温碳化Zn-MOFs, 得到了具有高比表面积(1 700 m²/g)的碳材料, 将其用于N-糖链的富集取得了良好的效果。Zhao等^[21]高温煅烧ZIF-67, 得到了高度有序的介孔碳材料并将其用于内源性肽段的富集, 取得了较好的效果。

本文采用层层自组装法制备得到了具有核壳结构的磁性纳米材料Fe₃O₄@MIL-100(Fe), 在氮气保护下高温煅烧, 得到最终的磁性介孔碳材料Fe₃O₄@MC。该材料具有高碳含量, 可以有效吸附内源性肽段。此外, 该材料具有超顺磁性, 可以实现材料与样品的快速分离。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

4800plus型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS, 美国AB Sciex公司); S3400型真空式扫描电子显微镜(SEM)、JEM-2100型透射电子显微镜(TEM)(日本JEOL公司); Max2550VB/PC型X-射线衍射仪(日本Rigaku公司); APOLLO X型能谱仪(EDS, 美国EDAX公司); TriStar Ⅱ 3flex型氮气吸附/脱附分析由全自动比表面及孔隙度分析仪(美国Micromeritics公司)。

1, 3, 5-苯三甲酸(H₃Btc)、六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)、无水乙酸钠(NaAc)、巯基乙酸(MAA)均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 乙二醇(EG)、乙醇(EtOH)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)购于上海凌峰试剂有限公司; 尿素(urea)、碳酸氢铵(NH₄HCO₃)购于国药集团化学试剂有限公司; 牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、胰蛋白酶(trypsin)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)均购于美国Sigma Aldrich公司。人血清由华东理工大学校医院提供。

1.2 Fe₃O₄@MC的制备

称取1.35 g FeCl₃·6H₂O和3.6 g NaAc, 分散于75 mL EG中, 搅拌30 min, 将混合均匀的溶液转移至反应釜中, 于200 ℃反应16 h, 得到Fe₃O₄颗粒。

称取400 mg Fe₃O₄颗粒, 分散于60 mL EtOH中, 随后加入20 μL MAA, 室温搅拌24 h, 得到Fe₃O₄@MAA。

称取100 mg Fe₃O₄@MAA材料, 分散于5 mL含10 mmol/L FeCl₃·6H₂O的EtOH溶液中, 于室温下超声15 min, 用EtOH清洗3次, 除去未吸附的FeCl₃·6H₂O。将材料分散于5 mL含10 mmol/L H₃Btc的EtOH溶液中, 于70 ℃水浴加热30 min, 用EtOH清洗3次。上述步骤重复30次, 得到Fe₃O₄@MIL-100(Fe)。

在氮气保护下, 将Fe₃O₄@MIL-100(Fe)材料置于管式炉中, 于700 ℃反应2 h, 最终得到磁性纳米材料Fe₃O₄@MC。

1.3 样品前处理

称取1.2 mg BSA, 溶于1.2 mL含8 mol/L尿素和50 mmol/L NH₄HCO₃的水溶液中, 加入24 μL 1 mol/L DTT, 于60 ℃反应1 h, 加入8.6 mg IAA, 于暗室反应45 min, 加入30 μg胰蛋白酶, 于37 ℃下酶解16 h, 分装冻干, 置于-20 ℃冰箱中备用。

量取10 μL人血清, 加入90 μL超纯水稀释, 煮沸5 min, 以5 000 r/min离心10 min后, 置于-20 ℃冰箱中备用。

1.4 肽段/内源性肽段富集流程

将0.5 mg Fe₃O₄@MC材料分散于400 μL超纯水中, 加入2 μL 1 μg/μL的BSA酶解液, 将10 μL预处理的人血清或者0.5 μL 1 μg/μL的BSA酶解液与50 μg或200 μg的BSA混合, 孵育30 min, 磁铁辅助下分离, 弃除上清液, 用超纯水清洗材料。加入10 μL ACN-H₂O-TFA洗脱液(80:19.9:0.1, v/v/v), 孵育10 min, 磁分离后收集洗脱液, 洗脱过程重复两次, 将收集到的洗脱液用于后续MALDI-TOF MS分析。

1.5 质谱分析

利用MALDI-TOF MS鉴定酶解液及人血清中多肽, 脉冲激光波长设定355 nm, 模式为反射正离子, 采用掺钕钇铝石榴石晶体(Nd/YAG)激光源。将0.5 μL洗脱液与0.5 μL 2, 5-二羟基苯甲酸(DHB)基质依次滴在样品靶上, 结晶后即可进行质谱分析。

2 结果与讨论

2.1 Fe₃O₄@MC的表征

通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察Fe₃O₄@MIL-100(Fe)和Fe₃O₄@MC的形貌和结构。如图 1所示, Fe₃O₄@MIL-100(Fe)和Fe₃O₄@MC均为球型结构, 粒径约为300 nm, MOFs层厚度约为20 nm。对比Fe₃O₄@MIL-100(Fe)和Fe₃O₄@MC的TEM图可知, 高温煅烧后, 材料的形貌和结构没有发生明显变化。

图 1

Fig. 1

图 1 Fe3O4@MIL-100(Fe)和Fe3O4@MC的扫描电镜图和透射电镜图 Fig. 1 Scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM) images of Fe3O4@MIL-100(Fe) and Fe3O4@MC

采用EDS对Fe₃O₄@MIL-100(Fe)和Fe₃O₄@MC的元素组成和含量进行分析。与Fe₃O₄@MIL-100(Fe)相比, Fe₃O₄@MC中碳含量由2.51%增加到6.79%(见图S1, 详见http://www.chrom-China.com, 下同), 这主要是因为在氮气保护下高温煅烧, MIL-100(Fe)中有机组分发生碳化导致碳含量增加。

X-射线衍射仪用于表征材料的晶型结构。如图 2所示, 14.1°、18.2°和20.2°处出现的衍射峰是MOFs材料MIL-100(Fe)的特征峰, 经过高温煅烧后, MIL-100(Fe)的衍射峰消失, 23.6°出现的宽峰归属于石墨化碳的002晶面。说明经过高温煅烧, MIL-100(Fe)中的碳组分成功转化为石墨化碳。

图 2

Fig. 2

图 2 (a) Fe3O4@MC和(b) Fe3O4@MIL-100(Fe)的X-射线衍射图 Fig. 2 X-ray diffraction (XRD) spectra of (a) Fe3O4@MC and (b) Fe3O4@MIL-100(Fe)

氮气吸附/脱附仪用于测定Fe₃O₄@MIL-100(Fe)和Fe₃O₄@MC磁性纳米材料的比表面积与孔径分布。如图S2a所示, Fe₃O₄@MIL-100(Fe)纳米材料为Ⅳ型吸附脱附等温线, 计算得到该材料的比表面积为138.40 m²/g; 孔径分布如图S2c所示, 平均孔径为4.24 nm。经过高温煅烧后, 比表面积降为5.18 m²/g, Fe₃O₄@MC纳米材料的粒径分布如图S2d所示, 孔分布范围较宽, 平均孔径为17.78 nm。推测Fe₃O₄@MC磁性纳米材料呈现高尔夫状大孔结构, 高温煅烧时MOFs结构改变, 形成了多种孔径分布, 可用于体积排阻的介孔数量明显减少, 随之形成了一些较大的孔道, 导致了比表面积下降。

2.2 Fe₃O₄@MC磁性纳米材料用于标准蛋白质酶解液中肽段的富集

样品酶解过程中由于加入的尿素、碳酸氢铵等无机盐的干扰, 直接对牛血清白蛋白酶解液进行质谱分析只检测到了少量的肽段, 且信号较低、信噪比很差(见图 3a)。经Fe₃O₄@MC磁性纳米材料的富集, 检测到33条高信号、高信噪比的肽段(见图 3b), 肽段质荷比、序列和位点见表S1。优越的富集效率得益于Fe₃O₄@MC磁性纳米材料的高碳含量。基于碳组分与肽段间的强疏水相互作用, 牛血清白蛋白酶解液中大部分肽段被Fe₃O₄@MC磁性纳米材料吸附。

图 3

Fig. 3

图 3 经Fe3O4@MC富集(a)前、(b)后BSA酶解液的MALDI-TOF MS质谱图 Fig. 3 MALDI-TOF MS spectra of the bovine serum albumin (BSA) digest (a) before and (b) after enriching by Fe3O4@MC magnetic nanoparticles * Peptides from BSA digest.

为了考察Fe₃O₄@MC磁性纳米材料的选择性, 以牛血清白蛋白作为干扰物。当BSA酶解液与BSA质量比为1:100时, 直接分析BSA酶解液与BSA的混合溶液(见图 4a), 由于高浓度蛋白质的干扰, 只检测到12条肽段, 且信号较弱, 氨基酸序列为LGEYGFQNALIVR(m/z 1 480.7 062)的肽段的信噪比(390.93)极低。经Fe₃O₄@MC磁性纳米材料富集后, 检测到26条肽段(见图 4b), 氨基酸序列为LGEYGFQNALIVR(m/z 1 480.7 062)的肽段的信噪比(1 168.43)明显增强。当酶解液与蛋白质质量比高达1:400时, 仍能检测到25条高信号、高信噪比的肽段(见图 4c), 所选肽段信噪比(1 029.29)基本保持不变。这一结果说明在高浓度蛋白质的干扰下, Fe₃O₄@MC磁性纳米材料仍可以高效、高选择性地富集肽段。

图 4

Fig. 4

图 4 不同比例的BSA酶解液与BSA混合物的MALDI-TOF MS质谱图 Fig. 4 MALDI-TOF MS spectra of different mass ratios of BSA digest and BSA a. direct analysis, m(BSA digest:BSA)=1:100; b. enriched by Fe3O4@MC magnetic nanoparticles, m(BSA digest:BSA)=1:100; c. enriched by Fe3O4@MC magnetic nanoparticles, m(BSA digest:BSA)=1:400.

2.3 Fe₃O₄@MC纳米材料用于人血清中内源性肽段的富集

Fe₃O₄@MC磁性纳米材料对于标准蛋白酶解液中的肽段有着优异的富集效果, 因此, 将其进一步应用于复杂生物样品人血清中内源性肽段的富集。从图 5a可以看出, 直接对人血清进行质谱分析, 血清中存在的高丰度蛋白质、脂质等组分严重干扰了内源性肽段的检测。因此, 只检测到少量内源性肽段, 且肽段信号峰的强度极弱。经Fe₃O₄@MC磁性纳米材料富集后, 检测到大量高信号、高信噪比的内源性肽段(见图 5b), 说明Fe₃O₄@MC磁性纳米材料对于复杂的实际样品有着较好的富集效果。

图 5

Fig. 5

图 5 经Fe3O4@MC磁性纳米材料富集(a)前、(b)后人血清的MALDI-TOF MS质谱图 Fig. 5 MALDI-TOF MS spectra of human serum (a) before and (b) after enriching by Fe3O4@MC magnetic nanoparticles

3 结论

本文制备得到了高碳含量、大孔径的磁性纳米材料Fe₃O₄@MC。基于碳材料与肽段间的强疏水作用及强磁性, Fe₃O₄@MC可以高效富集BSA酶解液中的33条特征肽段。此外，该材料对于复杂样品人血清中内源性肽段也具有较好的富集效果。Fe₃O₄@MC磁性碳材料的成功制备为多肽组学的分离分析提供了更多的选择。

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