色谱  2016, Vol. 34 Issue (5): 520-527   PDF (1483 KB)    
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林麒
李国波
葛品
许榕仙
林国斌
气相色谱-质谱联用法检测母乳脂肪中反式脂肪酸
林麒1, 李国波2, 葛品2, 许榕仙3, 林国斌1     
1. 福建省人兽共患病研究重点实验室(福建省疾病预防控制中心), 福建 福州 350001;
2. 福建省妇幼保健院(福建省妇儿医院), 福建 福州 350001;
3. 福建医科大学公共卫生学院, 福建 福州 350108
收稿日期: 2016-01-03
基金项目: 福建省科技重大专项(2013YZ0002-1);福建省医药创新课题项目(2014-CXB-7).
通讯联系人: 林国斌, Tel: (0591)87512340, E-mail: linguobinfj@163.com.
摘要: 建立了母乳中反式脂肪酸(TFAs)的气相色谱-质谱(GC-MS)检测方法,并应用于母乳脂肪中TFAs的检测。母乳用氨水水解,乙醚和石油醚提取脂肪,提取的脂肪加入C21: 0内标,用三氟化硼甲醇溶液在80℃水浴中冷凝回流15 min进行甲酯化,正己烷提取,上清液用GC-MS分析,内标法定量。在低、中、高加标水平上验证方法的准确度与精密度,结果显示该方法可用于母乳中18种TFAs及其同分异构体的检测,其中12种TFAs在母乳脂肪中的方法检出限为4.0~47.1 mg/kg,回收率为80%~113%, RSD为2.9%~14.5%(n=6)。TFAs在部分母乳脂样品中检出,含量为9.54~6.9 mg/kg。该方法定性、定量准确,可有效用于母乳中TFAs的检测,但仍存在脂肪酸本底干扰等问题,可结合银离子固相萃取柱预分离技术进一步完善。
关键词: 气相色谱-质谱     反式脂肪酸     母乳     脂肪    
Determination of trans-fatty acid isomers in human milk fat by gas chromatography-mass spectrometry
LIN Qi1, LI Guobo2, GE Pin2, XU Rongxian3, LIN Guobin1     
1. Fujian Provincial Key Laboratory of Zoonosis Research(Fujian Center for Disease Control & Prevention), Fuzhou 350001, China;
2. Fujian Maternal and Child Health Care Hospital(Fujian Women and Children's Hospital), Fuzhou 350001, China;
3. Public Health School of Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China
Received: 2016-01-03
Foundation item: Science and Technology Important Project in Fujian Province (No. 2013YZ0002-1); Pharmaceutical Innovation Subject in Fujian Province (No. 2014-CXB-7).
Abstract: A method for the determination of trans-fatty acid isomers in human milk fat was developed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and applied to analyze TFAs in human milk fat. The fat was extracted with diethylether and petroleum ether after ammonia hydrolysis of human milk. C21: 0 internal standard and boron trifluoride methanol solution were added to the extract for fat esterification. The solution then was refluxed in 80℃ water bath for 15 min. Finally the trans-fatty acid methyl ester isomers were extracted with hexane, and analyzed by GC-MS. GC conditions were as follows: an HP-88 column (100 m×0.25 mm×0.2 μ m) with inlet temperature of 260℃, at a split ratio of 10: 1, and a He flow rate of 1 mL/min. The initial column temperature was 140℃ (held for 5 min), then raised up to 240℃ at a rate of 4℃/min (held for 15 min). The electronic ionization (EI) source energy was 70 eV, with auxiliary (AUX) temperature of 280℃, ion source temperature of 230℃, quadrupole temperature of 150℃ in selected ion monitoring (SIM) mode. This method can analyze the 18 TFAs. The method detection limits (MDLs) of 12 TFAs were 4.0-47.1 mg/kg, and the average recoveries were 80%-113% with the relative standard deviation (RSD, n=6) range of 2.9%-14.5%. TFAs were detected in some real samples and the contents were 9.5-46.9 mg/kg. The method is reliable and sensitive, and would be better if the background interference of fatty acids should be diminished by silver ion solid phase extraction.
Key words: gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)     trans-fatty acids (TFAs)     human milk     fat    

反式脂肪酸(TFAs)是一类包含一个或多个反式构型双键的不饱和脂类化合物。主要来源于工业中植物油的氢化过程和反刍动物的生物氢化过程。TFAs可引起代谢紊乱,影响血脂水平,激发系统炎症和诱发内皮功能紊乱,还会导致内脏脂肪过多、体重增加和胰岛素抵抗[1]。

TFAs还可通过膳食影响孕产妇体脂及产妇母乳脂成分,通过胎盘或母乳影响婴幼儿健康[2]:影响母乳必需脂肪酸含量[3],影响胎儿生长[4],造成胎儿丢失[5],影响婴幼儿发育[6],造成母亲的不孕不育[7]、母婴肥胖[8]和儿童过敏[9]与哮喘[10]等健康损害。

目前检测TFAs的方法包括红外吸收光谱法(IR)、毛细管电泳法(CE)、银离子高效液相色谱法(Ag+-HPLC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、银离子薄层色谱法(Ag+-TLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等[11]。Ag+-色谱法一般只作为GC分析之前的样品净化步骤;IR法有简便、快速(仅需5 min)的优点,但缺点是只能获得TFAs的总含量,无法获知单个TFAs的详细信息。因此目前广泛用于食品中TFAs的分析方法主要是GC法[12]，但多为GC-FID方法测定食品[13]、油脂[14]等少数几种样品中的TFAs,而对母乳与乳制品等样品中的TFAs研究较少。近年国内外仅见李蕊等[15]、Li等[16]和Daud等[17]的研究。同时TFAs组成复杂,标准品种类有限,传统的GC法很难判别一些未知色谱峰,而GC-MS则有明显的优势。

因此本研究建立了母乳脂肪中TFAs各同分异构体及其含量的GC-MS分析方法,包括母乳中TFAs的提取,MS与内标法对14～22碳的多种TFAs进行准确定性、定量,并对福州地区产后42 d母乳中的TFAs进行了测定,为母乳中TFAs的检测方法做出有益探索。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪(6890/5973i GC-MSD,Agilent); HP-88色谱柱(100 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent)。天平(BS110S,赛多利斯)。冷冻离心机(Allegra X-12R centrifuge,Beckman);水浴锅(GD100,Grant)。

内标:C21：0标准品(100 mg,纯度99%,Across Organics);外标:13种反式脂肪酸甲酯混合标准品(GLC 481B,Lot N30-U,100 mg,纯度＞99%,Nu-chek),亚麻酸甲酯混合标准品与亚油酸甲酯混合标准品溶液(Catalog No.47792、Catalog No.47791,10 mg/mL,SUPELCO),37种脂肪酸甲酯混合标准品溶液(10 mg/mL,用于TFAs干扰研究,AccuStandard);标准参考物:奶粉标准参考物(Standard Reference Material 1849a Infant/Adult Nutritional Formula,National Institute of Standards and Technology,USA)。

无水乙醇(优级纯)、石油醚(分析纯,沸程30～60 ℃)、乙醚(分析纯)、氨水(优级纯,含量25%～28%)、三氟化硼甲醇溶液(含量14%,CNW),正己烷(色谱纯,Fisher)。

标准使用液的配制如下。C21：0内标使用液的配制:称取10.72 mg,用正己烷定容至10.0 mL,质量浓度为1 072 μg/mL; 13种反式脂肪酸甲酯混合标准品溶液的配制:称取约50 mg混合标准品,用正己烷定容至10.0 mL;混合标准使用液的配制:13种反式脂肪酸甲酯混合标准品溶液、亚油酸甲酯混合标准品溶液和亚麻酸甲酯混合标准品溶液各移取1.0 mL,氮吹浓缩至1.0 mL。具体浓度如表 1所示。

表1 反式脂肪酸甲酯混合标准溶液的质量浓度 Table 1 Mass concentrations of trans-fatty acid methyl ester in mixed standard solutions
1.2 实验过程
1.2.1 脂肪的提取

采集产后42 d产妇的母乳20 mL,立即送至实验室于-20 ℃下保存,分析时母乳恢复至室温,取10 g (精确到0.1 mg)于抽脂管中,加2 mL氨水,于65 ℃水浴中加热15 min,取出冷至室温,加入10 mL乙醇，混匀。分别加入25 mL乙醚和25 mL石油醚,振摇1 min,静置,抽提有机层。重复乙醚、石油醚提取步骤两次,合并抽提液于蒸发皿中,水浴蒸干并恒重。

1.2.2 脂肪甲酯化

称取母乳脂肪约50 mg(精确到0.1 mg),加入20 μL C21：0内标使用液、三氟化硼甲醇溶液5 mL,80 ℃水浴中冷凝回流15 min。冷却至室温,移入50 mL离心管中,用3 mL饱和NaCl溶液清洗烧瓶3次,合并于离心管中。加入2 mL正己烷,振摇1 min,于5 000 r/min离心5 min,上清液进行GC-MS分析。

1.2.3 色谱条件

色谱柱:Agilent HP-88(100 m×0.25 mm×0.2 μm);进样口温度:260 ℃;分流比:10：1;载气:He;流量:1.0 mL/min;检测器温度:280 ℃;升温条件:140 ℃(5 min),以4 ℃/min升至240 ℃(15 min);进样量:1.0 μL。

1.2.4 质谱条件

离子源:电子轰击电离(EI);电子能量:70 eV;接口温度:280 ℃;离子源温度:150 ℃;四极杆温度:150 ℃;选择离子监测(SIM)模式。

2 结果与讨论
2.1 定性分析与定量离子的选择

全扫描得到总离子流图(TIC),并根据脂肪酸(FA)的色谱保留时间规律与质谱特征[18]确定保留时间(RT)与定量、定性离子,建立SIM方法。

FA的色谱保留时间规律如下。(1)不同碳数的FA:碳数小的先出峰,碳数大的后出峰;(2)相同碳数的FA:饱和的先出峰,不饱和的后出峰,不饱和度越大(双键数目越多)的越后出峰;(3)不饱和FA双键数目相同而位置不同的异构体:双键位置数字小的先出峰,双键位置数字大的后出峰;两个以上双键,其位数之和小的先出峰,位数之和大的后出峰;(4)碳数、双键数目、双键位置均相同的FA:反式的先出峰,顺式的后出峰。

FA的质谱特征如下。(1)通过基峰确定不饱和度(即双键数目):基峰m/z 74为饱和FA,基峰m/z 55为含1个双键的不饱和FA,基峰m/z 67为含2个双键的不饱和FA,基峰m/z 79为含3个以上双键的不饱和FA; (2)通过分子离子峰确定FA的碳数;(3)再通过[M-43]+、[M-32]+、[M-31]+、重排离子做进一步确证。通过以上规律即可获得定性与定量离子对。具体过程如图 1、图 2所示。

图1 硬酯酸甲酯的质谱碎裂途径 Fig.1 MS cleavage process of stearic acid methyl ester

图2 反式油酸甲酯的质谱碎裂途径 Fig.2 MS cleavage process of trans-oleic acid methyl ester

TFAs保留时间、定量离子和特征离子如表 2所示,TFAs标准色谱图与样品加标色谱图分别如图 3、图 4所示。

表2 反式脂肪酸甲酯的保留时间(RT)、质谱定量离子(QI)与特征离子(CI) Table 2 Retention times (RTs), MS quantitative ions (QIs) and characteristic ions (CIs) of trans-fatty acid methyl esters

图3 反式脂肪酸甲酯混合标准溶液的色谱图 Fig.3 Chromatogram of trans-fatty acid methyl ester mixed standard solutions Peak identifications: 1. RT 19.29 min, C14：1T (9t-C14：1); 2. RT 21.04 min, C15：1T (10t-C15：1); 3. RT 22.62 min, C16：1T (9t-C16：1); 4. RT 24.30 min, C17：1T (10t-C17：1); 5. RT 25.86 min, C18：1T (6t-C18：1); 6. RT 25.89 min, C18：1T (9t-C18：1); 7. RT 25.95 min, C18：1T (11t-C18：1); 8. RT 26.80 min, C18：2n6t (9t,12t-C18：2); 9. RT 27.13 min, C18：2n6 (9c,12t-C18：2); 10. RT 27.27 min, C18：2n6 (9t,12c-C18：2); 11. RT 27.34 min, C19：1T (7t-C19：1); 12. RT 27.42 min, C19：1T (10t-C19：1); 13. RT 27.86 min, C18：3n3 (9t,12t,15t-C18：3); 14. RT 28.24 min, C18：3n3 (9t,12t,15c-C18：3)+C18：3n3 (9t,12c,15t-C18：3); 15. RT 28.39 min, C18：3n3 (9c,12t,15t-C18：3)+C18：3n3 (9c,12c,15t-C18：3); 16. RT 28.73 min, C18：3n3 (9c,12t,15c-C18：3)+C18：3n3 (9t,12c,15c-C18：3); 17. RT 28.86 min, C20：1T (11t-C20：1); 18. RT 31.75 min, C22：1T (13t-C22：1). Standard levels: 140-800 μg/mL.

图4 反式脂肪酸甲酯的加标样品色谱图 Fig.4 Spiked sample chromatograms of trans fatty acid methyl esters Peak identifications are the same as in Fig.3. Spiked levels: 100-400 mg/kg.
2.2 乳脂提取方法的选择

分别用酸水解法、碱水解法和三氯甲烷-甲醇(1：1,v/v)提取法[16]对奶粉标准参考物进行脂肪测定。碱水解法的结果(29.58%±0.16%,n=2)与标准值(30.43%±0.95%)最接近;酸水解法的结果偏低(24.61%±0.11%,n=2);三氯甲烷-甲醇法的结果偏高(45.56%±0.17%,n=2)，且恒重时杂质发生碳化,不利于进一步的甲酯化。同时国家标准《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》[19]也采用碱水解法。因此本研究采用碱水解法进行母乳脂肪提取。

2.3 甲酯化方法与内标的选择

常见的甲酯化方法有甲醇钠-甲醇法、KOH-甲醇法、浓硫酸-甲醇法和三氟化硼-甲醇法。李培武等[20]比较的结果表明:三氟化硼-甲醇法适于FA与TFAs绝对含量的测定;KOH-甲醇法常温下酯化效果好,操作简单,特别适合相对量分析;浓硫酸-甲醇法和三氟化硼-甲醇法虽然需长时间(1～3 h)冷凝回流,且浓硫酸具强腐蚀性,三氟化硼对人体有害,但这两种方法酯化时间长、温度高(80～120 ℃)、酯化率高,测定值接近于真实值,更适合绝对含量的测定。

本研究测定母乳脂肪中TFAs的绝对含量,并覆盖了14～22碳区的TFAs[21],因此我们选择三氟化硼-甲醇法,并采用美国化学家协会(ACS)推荐的C21：0为内标。

我们选用L9 (34)正交设计表对甲酯化方法进行优化,由于没有TFAs样品,取母乳脂肪50 mg进行甲酯化(n=3),以常见的油酸(9c-C18：1)、亚油酸(9c,12c-C18：2)脂肪酸甲酯峰面积均值进行比较并进行方差分析(见表 3和表 4)。

表3 正交试验的安排和结果(n=3) Table 3 Arrangement and results of the orthogonal experiment (n=3)

表4 油酸与亚油酸甲酯峰面积的方差分析表 Table 4 ANOVA table of peak areas of methyl oleate and methyl linoleate

方差分析发现,各因素对甲酯化的效果影响均无显著性。按可操作性强,反应完全的原则。我们选择峰面积最大的条件6。考虑到反应的充分性,延长甲酯化时间。最终条件为水浴温度80 ℃,三氟化硼甲醇溶液用量5 mL,加热时间15 min。

2.4 色谱条件的优化
2.4.1 色谱柱

根据文献[12],分析TFAs的色谱柱有SP2340、SP-2560、CP-Sil88、HP-88和BPX-70等。比较了CP-Sil88(100 m×0.25 mm×0.2 μm)与HP-88(100 m×0.25 mm×0.2 μm)两种色谱柱对FA和TFAs的分离效果。具体步骤如下:37种脂肪酸混合标准品溶液、13种反式脂肪酸混合标准品溶液、4种亚油酸混合标准品溶液和8种亚麻酸混合标准品溶液分别进样。升温条件参考GB 5413.27-2010: 140 ℃(保持5 min),以4 ℃/min升至240 ℃(保持15 min)。结果如图 5所示。

图5 CP-Sil88和HP-88柱的分离色谱图 Fig.5 Chromatograms obtained by CP-Sil88 column and HP-88 column Black: 37 fatty acid methyl ester standards solution (20-40 μg/mL); Blue: trans-fatty acid methyl ester mixed standards solution (20-40 μg/mL); Red: methyl linolenate mixed standards solution (4-45 μg/mL); Green: methyl linoleate mixed standards solution (10-50 μg/mL). Peak identifications on CP-Sil88 column: 1. RT 27.4 min, 9c,12t-C18：2+7t-C19：1 (green+blue); 2. RT 28.7 min, 9t,12t,15c-C18：3+9t,12c,15t-C18：3 (red); 3. RT 28.9 min, 9c,12t,15t-C18：3+9c,12c,15t-C18：3+6c, 9c,12c-C18：3+11t-C20：1 (red+black+blue); 4. RT 29.2 min, 9c,12t,15c-C18：3+9t,12c,15c-C18：3+11c-C20：1 (red+black); 5. RT 31.7 min, 8c, 11c, 14c-C20：3+13t-C22：1 (black+blue). Peak identifications on HP-88 column: 1. RT 27.3 min, 9t,12c-C18：2+7t-C19：1 (green+blue); 2. RT 28.2 min, 9t,12t,15c-C18：3+9t,12c,15t-C18：3 (red); 3. RT 28.3 min, C20：0+6c, 9c,12c-C18：3 (black); 4. RT 28.4 min, 9c,12t,15t-C18：3+9c,12c,15t-C18：3 (red); 5. RT 28.7 min, 9c,12t,15c-C18：3+9t,12c,15c-C18：3 (red).

可以看出,除了TFAs中的反式亚麻酸同分异构体均无法基线分离(CP-Sil88中的2、3和4号峰,HP-88中的2、4和5号峰)外,CP-Sil88中1、3和5号重叠峰还含其他TFAs,而HP-88中仅1号峰含TFAs,且可利用质谱不同的定量离子进行分离与定量。因此选用HP-88色谱柱进行TFAs分析。

2.4.2 升温条件

由于亚麻酸同分异构体的质谱图与定量离子相同,无法通过不同的定量离子进行定量,我们对分离条件进行了优化,努力达到基线分离。分离条件分别为:(1)140 ℃(保持5 min),以4 ℃/min升至240 ℃(保持15 min); (2)140 ℃(保持5 min),以4 ℃/min升至220 ℃,再以1 ℃/min升至240 ℃(保持15 min); (3)140 ℃(保持5 min),以4 ℃/min升至220 ℃(保持30 min)。结果发现不同的升温速率下,重叠峰的分离效果无明显变化,如果升温速率过慢,会造成出峰时间延长,峰宽过大,峰形变差。因此我们选择的升温条件为:140 ℃(保持5 min),以4 ℃/min升至240 ℃(保持15 min),无法分离的峰合并定量。

2.5 方法的线性范围、检出限(MDL)与回收率

以正己烷配制系列浓度混合标准使用液,重复进样6次,以被测组分质量浓度(μg/mL)为x,外标与内标平均峰面积比为y,绘制标准曲线。通过稀释标准溶液测定仪器检出限(IDL)。结果如表 5所示。

表5 TFAs的线性范围、回归方程、相关系数(r)和仪器检出限(IDL)(n=6) Table 5 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r) and instrument detection limits (IDL) of trans-fatty acids (n=6)

比较了国内外多种检出限的计算方法[22],选择美国EPA方法[23],参考IDL,选择合适的加标水平(1～5倍的MDL),重复制备7个以上的样品,计算多次测量信号的标准偏差(s),代入公式MDL=st(n-1,1-α)，其中:s为加标样品测试结果的标准偏差;t为自由度n-1和置信区间1-α时t界值表中查得的值,当n=7时,在99%置信区间(α=0.01)下,t=3.14; n为加标样品数量,n≥7。由3倍MDL确定定量限(LOQ)。

参考MDL,取约50 mg母乳脂肪进行低、中、高水平的加标试验(n=6),计算方法的回收率。其中7t-C19：1、10t-C19：1、9c,12t,15t-C18：3+9c,12c,15t-C18：3和11t-C20：1由于样品基质干扰,无法计算MDL与回收率,其他分析物的结果如表 6所示。

表6 母乳脂肪中反式脂肪酸的加标回收率、相对标准偏差和方法检出限(n=6) Table 6 Spiked recoveries, relative standard deviations (RSDs) and method detection limits (MDLs) of trans-fatty acids in human milk fat (n=6)

从表 6可以看出,方法检出限为4.9～47.1 mg/kg,3个加标水平的回收率在80%～113%之间,RSD(n=6)为2.9%～14.5%,该方法准确可靠。

2.6 实际样品的检测

采用上述建立的方法,对采集的母乳进行了测定,母乳来源、种类、获取方法和时间与文献[24]相同。如表 7所示，测定的136份样品中部分检出TFAs,其中9t-C16：1、9c,12t-C18：2、9c,12t,15c-C18：3+9t,12c,15c-C18：3和9t,12c-C18：2的检出率较高。检出的TFAs含量在9.5～46.9 mg/kg之间。阳性样品色谱图如图 6所示。

表7 母乳脂肪中TFAs的测定结果(n=136) Table 7 Determination results of TFAs in human milk fat samples (n=136)

图6 反式脂肪酸阳性样品的色谱图 Fig.6 Chromatogram of a positive sample with trans-fatty acids Peak identifications: 1. RT 22.62 min, C16：1T (9t-C16：1); 2. RT 26.80 min, C18：2n6t (9t,12t-C18：2); 3. RT 27.27 min, C18：2n6 (9t,12c-C18：2); 4. RT 28.73 min, C18：3n3 (9c,12t,15c-C18：3)+C18：3n3 (9t,12c,15c-C18：3).
3 结论

采用碱水解法提取乳脂,用三氟化硼甲酯化,GC-MS定性,内标法定量,并进行了相关的方法验证与样品测定。与GC-FID法相比,定性准确,但仍存在脂肪酸本底干扰的问题。以后研究中可进一步用银离子固相萃取柱预分离技术加以完善。实际样品测定中,TFAs在部分母乳样品中检出,但含量均较低。

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