多不饱和脂肪酸(PUFA)是指含有两个或两个以上不饱和双键且碳原子数为16～22的直链脂肪酸,也叫多烯脂肪酸。多不饱和脂肪酸根据第一个双键出现的位置可以分为omega-3、omega-6、omega-7和omega-9系列,其中omega-3和omega-6系列多不饱和脂肪酸具有重要的生物学作用。亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是典型的omega-3系列多不饱和脂肪酸,双高-γ-亚麻油酸(DGLA)、亚油酸(LA)和花生四烯酸(AA)是典型的omega-6系列多不饱和脂肪酸。

类二十烷酸(eicosanoids)也称类花生酸,是一大类由二十碳多不饱和脂肪酸(AA、EPA、DGLA等)氧化产生的具有生物活性的物质。Astarita等^[1]将类二十烷酸的概念进一步扩大,将十八碳的不饱和脂肪酸(LA和ALA)和二十二碳的不饱和脂肪酸(二十二碳五烯酸(DPA)和DHA)等经氧化产生的具有生物活性的物质一并归入类二十烷酸。大部分类二十烷酸由游离的AA生成。

如图 1所示,类二十烷酸的合成途径主要有以下4种。

图1

Fig. 1

图1 类二十烷酸的生物合成途径 Fig.1 Biosynthesis pathways of eicosanoids CYP450: cytochrome P450; COX: cyclooxygenase; LOX: lipoxygenase; EET: epoxy eicosatrienoic acid; HETE: hydroxyl eicosatetraenoic acid; PG: prostaglandin; TX: thromboxane; LT: leukotriene; LX: lipoxin.

(1)AA 等多不饱和脂肪酸经环氧合酶(COX)氧化可形成前列腺素类化合物(PGs)和血栓烷素类化合物(TXs)。PGs为前列腺酸的衍生物,根据五碳环上取代基和双键位置不同,可分为9种类型:PGA₂、PGB₂、PGC₂、PGD₂、PGE₂、PGF_2a、PGH₂、PGI₂和PGJ₂。TXs有前列腺酸骨架,但五碳环被含氧的恶烷所代替。

(2)AA经脂氧合酶(LOX)氧化产生代谢产物白三烯(LTs)、脂氧素(LXs)和羟基二十碳四烯酸(HETEs)。LTs为含有3个双键的不饱和脂肪酸,例如LTA₄、LTB₄、LTC₄、LTD₄、LTE₄和LTF₄等。LXs为含有3个羟基、4个共轭双键典型结构的不饱和脂肪酸。

(3)AA经细胞色素P450酶(CYP450)作用生成表氧化二十碳三烯酸(EETs)和HETEs。

(4)AA经非酶氧化途径生成异构前列腺素(iso-PGs)和HETEs等。

不同类型类二十烷酸代表性化合物的结构如图 2所示。

图2

Fig. 2

图2 部分类二十烷酸的结构 Fig.2 Structures of some eicosanoids

类二十烷酸以游离形式广泛存在于体液和组织中,在凝血^[2]、伤口愈合^[3]等人体生理活动中发挥着重要作用。类二十烷酸也是重要的炎症因子,PGE₂可诱发炎症,PGF_2a可抑制抗炎反应,PGEs和PGFs的平衡影响炎症过程的发展^[4]。大量的流行病学、临床和动物实验研究发现,许多疾病的发生、发展(如慢性炎症性疾病、肾脏疾病、高血压等)都与类二十烷酸的代谢异常存在着密切关系^{[5, 6]}。

研究发现,类二十烷酸与癌症也存在密切关系,可以通过调节肿瘤细胞的增殖、影响肿瘤炎性微环境和肿瘤免疫抑制等机制影响肿瘤的发生、发展^[7]。12-HETE是蛋白酶C和细胞色素所必需的细胞内信号分子,它可以刺激癌细胞的增生^[8]。经COX-2酶氧化生成的PGE₂可促进小鼠结肠癌细胞的增殖和转移^[9]。但类二十烷酸对癌症的具体作用机制还不明确,因此针对癌症中类二十烷酸变化的研究也成为了目前医学和药学的研究热点之一。

由于类二十烷酸在各种生理、病理刺激下因需生成并迅速释放,合成量少,稳定性较差,故类二十烷酸在生物样本内含量极低;且类二十烷酸的结构类似,存在大量同分异构现象,故对生物体内类二十烷酸进行分离和分析具有较大的挑战。

本文对近年来类二十烷酸分析方法的研究进展进行归纳总结,旨在为类二十烷酸的分析和应用提供参考。

生物样本尤其是血样中含有蛋白质、尿素、磷脂等大量内源性物质^[10],通常会对类二十烷酸的分析存在干扰。在进行分析前将游离的类二十烷酸从生物样本中提取出来,可以有效减少基质中高丰度物质(如磷脂)的干扰,从而更准确地对类二十烷酸进行分析。因类二十烷酸为内源性物质,通常使用同位素标记的类二十烷酸来评估提取回收率。固相萃取(SPE)和液液萃取(LLE)是常用的提取方法。

SPE基于液-固色谱理论,采用选择性吸附和选择性洗脱的方式,通过选用适宜的溶剂,按照上样、洗涤、洗脱等步骤对样品进行富集、分离和净化^[11]。运用SPE法提取生物样本中的类二十烷酸是目前最常用的提取方法,使用的SPE柱多为商品化的反相C18柱、聚合物固相萃取小柱或者阴离子交换树脂小柱^[12]。溶剂多选用不同比例的甲醇和水。

Abromeit等^[13]选用7种类二十烷酸标准品对4种不同填料的商品化SPE柱(C18柱、C8/SAX柱、聚合物WAX柱和聚合物复合型SAX柱)的提取回收效率进行评估。C18柱的回收率明显低于其他3种SPE柱。该方法仅对磷酸盐缓冲液(PBS)中的类二十烷酸标准品进行提取回收率考察,并未考察生物样本中类二十烷酸的提取回收率。Shaik等^[14]使用聚合物反相色谱(HLB)小柱提取大鼠脑组织中的类二十烷酸,分别用体积分数为5%的甲醇水溶液和100%的甲醇作为洗涤液和洗脱液,8个氘代内标的回收率均大于88%。

LLE法利用组分在不同溶剂中的溶解度不同而达到分离或提取的目的^[15]。通常选用不同比例的有机溶剂提取类二十烷酸,氯仿-甲醇^[16]和氯仿-异丙醇^[17]等有机溶剂都可用于LLE法提取类二十烷酸。LLE法操作方便,但需要大量有机溶剂。

Mangal等^[17]采用两步LLE法,先后使用氯仿-异丙醇和甲基叔丁基醚提取血浆中的类二十烷酸,除PGD₂、TXB₂和11d-TXB₂的回收率较低外,其余22种非氘代类二十烷酸回收率均在92%～143%。Ostermann等^[18]通过比较13种氘代类二十烷酸标准品的提取回收率对比了6种SPE方法和1种LLE方法的提取效率。SPE法选用不同材料的SPE柱(聚合物反相色谱柱、阴离子交换柱和C18柱)以及不同的萃取条件提取类二十烷酸,LLE法选用乙酸乙酯提取类二十烷酸。结果发现,SPE法的提取回收率略优于LLE法,其中C18柱有着较好的提取回收率和较小的基质效应。

本文对比了文献^{[17, 18]}中SPE法和LLE法对血浆中类二十烷酸的提取结果(见表 1),发现不同提取方法的回收率有较大差异。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同提取方法[17, 18]对血浆中3种代表性氘代类二十烷酸及类二十烷酸提取回收率的对比 Table 1 Comparison of the extraction recoveries of the three representative deuterated eicosanoids and eicosanoids in plasma with different extraction methods[17, 18] Extraction method SPE column Eluting solvent or extractant Eicosanoid Recovery/% SPE Oasis HLB methanol and ethyl acetate (d4)PGD*2 68 (d4)TXB2 64 (d4)LTB4 68 SPE Oasis HLB methanol (d4)PGD2 58 (d4)TXB2 58 (d4)LTB4 50 SPE Strata X methanol (d4)PGD2 37 (d4)TXB2 63 (d4)LTB4 88 SPE SepPak C18 methyl formate (d4)PGD2 77 (d4)TXB2 68 (d4)LTB4 85 SPE AnionEx-Weak n-hexane/ethyl acetate/acetic acid (d4)PGD2 79 (d4)TXB2 76 (d4)LTB4 78 SPE AnionEx-Strong n-hexane/ethyl acetate/acetic acid (d4)PGD2 53 (d4)TXB2 19 (d4)LTB4 66 LLE ethyl acetate (d4)PGD2 33 (d4)TXB2 27 (d4)LTB4 36 LLE chloroform/isopropanol and methyl tert-butyl ether PGD2 58 TXB2 47 LTB4 99 *(d4)PGD2, (d4)TXB2 and (d4)LTB4 are deuterated eicosanoids; d4 means that four hydrogen atoms have been replaced by deuterium.

表1 不同提取方法[17, 18]对血浆中3种代表性氘代类二十烷酸及类二十烷酸提取回收率的对比 Table 1 Comparison of the extraction recoveries of the three representative deuterated eicosanoids and eicosanoids in plasma with different extraction methods[17, 18]

影响类二十烷酸提取回收率的因素主要包括类二十烷酸与提取溶剂的性质、提取体积等,根据不同种类类二十烷酸的性质选用不同的条件分类提取类二十烷酸,减少提取步骤,反复多次提取可提高类二十烷酸的回收率,而标准化的操作流程则有利于提高提取的重现性。在生物样本中提取类二十烷酸时,LLE和SPE的联合使用可有效去除样本基质中的干扰物,利于后续分析。

酶免疫分析法(EIA)是定量分析类二十烷酸最常用的方法。EIA是利用抗原抗体特异性结合的原理,以酶标记的抗原或抗体作为示踪物,由高活性的酶催化底物显色或发光,从而进行定量分析的一种非放射性的分析方法^[19]。EIA检出限极低、灵敏度高、操作简单,但受限于商品化的酶示踪物和抗体种类及数量,难以进行高通量分析。EIA的专属性较差,抗体易与具有类似结构的非目标类二十烷酸发生交叉反应,出现假阳性的结果^[20]。EIA较多应用于实验和临床研究中。

Kowal-Bielecka等^[21]采用EIA对COX、5-LOX和15-LOX氧化生成的类二十烷酸进行分析。对32例硬皮性肺病患者、16例未患硬皮性肺病的系统硬化症患者和12例正常人的支气管肺泡灌洗液(BALf)中的LTB₄、PGE₂、15-HETE和LXA₄进行定量分析。发现LTB₄的含量在3组人中有显著性差异(p＜0.05),其机制有待进一步研究。

Ciebiada等^[22]采用EIA定量检测肺癌患者的呼出气冷凝液(EBC)和BALf中4种类二十烷酸8-isoprostane、LTB₄、cys-LTs和PGE₂并进行对比,发现EBC和BALf中的4种类二十烷酸含量变化呈正相关,即EBC中的类二十烷酸变化可反映其在BALf中的含量变化,因此监测EBC中类二十烷酸含量的变化有望成为一种监测肺癌疾病变化和评估治疗效果的无损伤监测方法。

Blanchard等^[23]采用EIA定量检测低剂量阿司匹林对人免疫缺陷病毒(HIV)相关的神经认知功能障碍模型动物(HIV-1转基因大鼠)脑组织中的PGE₂、LTB₄、8-isoprostane、15-HETE和LXA₄等9种类二十烷酸,发现长期用低剂量的阿司匹林喂食HIV-1转基因大鼠后,其脑组织中8-isoprostane、15-HETE、PGE₂和LTB₄显著性降低,这表明低剂量的阿司匹林可以降低炎症反应,上调大鼠脑组织中的AA代谢并促进神经认知功能障碍。

液相色谱是一项具有高分离效率、高选择性、高灵敏度、应用范围最广泛的色谱分离技术。与气相色谱不同,液相色谱的分离不需要高柱温,因此液相色谱可以分离热不稳定、不易挥发的样品。但由于大多数类二十烷酸不具有紫外吸收性能或紫外吸收较弱,常用的紫外检测器(UVD)并不适用于类二十烷酸的定量分析,蒸发光散射检测器(ELSD)虽是一种通用型检测器,其较差的灵敏度难以适用于含量极低的类二十烷酸的检测。荧光检测器(FLD)具有高选择性和高灵敏度,但其仅对荧光物质有响应,因此需要选择合适的荧光标记物对类二十烷酸进行衍生化。

Aghazadeh-Habashi等^[24]为提高HPLC检测类二十烷酸的灵敏度,选用荧光标记物2-(2,3-naphthalimino)ethyl-trifluoromethanesulphonate (NE-OTf)对12种类二十烷酸进行标记,并利用HPLC-FLD建立了一套具有较高灵敏度、高选择性的分析方法。该方法定量限为10 g/L,且在10～250 g/L的质量浓度范围内线性关系良好,也具有较好的准确度和精密度,但是该方法仍需要对类二十烷酸进行衍生化处理,前处理步骤繁琐。

色谱-质谱联用技术将色谱卓越的分离能力和质谱的准确定性及定量优势相结合,是目前应用最广泛的技术。三重四极杆质谱具有强大的定量能力,其多反应监测(MRM)模式可通过选择性地采集母离子和相对应的特征子离子对共流出的不同种类的类二十烷酸和同分异构的类二十烷酸进行选择性检测^[25]。

GC是一项发展成熟并在各个领域中广泛应用的分离分析技术。GC利用被分析物质的沸点和极性的不同进行分离,具有高灵敏度、高分离效率和高通量的特点^[26]。质谱具有灵敏度高、精密度高和检出限低的优点,并且具有强大的结构鉴定能力^[27]。GC-MS技术将GC和MS的优点结合,可快速进行样本的分离和鉴定,并能对低浓度甚至是痕量物质进行定量分析。三重四极杆质谱具有强大的定量能力,其与GC的联用是近年来常用的类二十烷酸的定量分析方法^[28]。由于类二十烷酸自身不具有挥发性,在进行GC-MS分析之前需要对类二十烷酸进行衍生化,N-酰化、酯化等^[29]均是常用的衍生化方法。但是单一的一种化学衍生化试剂难以适用于所有不同种类的类二十烷酸的分析^[30],因此衍生化试剂的选择是影响GC-MS分析类二十烷酸的关键因素。

Goulitquer等^[31]基于GC-MS平台,采用负离子化学离子化(NICI)模式,选用氘代的AA作为内标,将4种EETs衍生化为五氟苄基酯后进行定量分析,并成功地将该方法应用在血浆和血细胞中的EET分析中。该方法具有较好的灵敏度和专属性,适用于程序化分析。

LC-MS将液相色谱的高分离效力和质谱的高灵敏度、高选择性和高定性能力结合,适合成分复杂的痕量物质的分析,能同时提供相对分子质量和结构信息^[32]。LC-MS既不需要繁琐的样品预处理过程也不需要很长的色谱运行时间来避免基质干扰,具有其他分析方法不可比拟的优点^[33]。液相色谱-三重四极杆质谱是类二十烷酸定量分析最常用的分析仪器,具有很好的灵敏度和专属性。

反相色谱柱常用于分离类二十烷酸及其相关代谢物。Dumlao等^[30]基于HPLC-Qtrap-MS/MS分析平台,选用负离子模式电喷雾电离(ESI^-)模式下的编程MRM检测方式,采用C18反相色谱柱和乙腈-水体系,对141种类二十烷酸进行分析,建立了一套高通量的液相色谱质谱分析方法。但该方法液相色谱分析时间较长,难以满足大批量样品的快速分析。

为提高液相色谱的分离能力,缩短液相色谱分离时间,超高效液相色谱(UPLC)应运而生。UPLC色谱柱的填料颗粒低于2 μm,具有超高柱效。UPLC具有分离度高、分析速度快、灵敏度高、选择性好等优点^[34]。

Wang等^[35]基于UPLC-Qtrap-MS/MS的分析平台,使用scheduled MRM模式和BEH shield RP18反相色谱柱,在ESI^-模式下,建立了一套高通量的快速分析方法。该方法检出限为5～100 pg,具有较好的线性、准确度和精密度,可在5 min内分离包括26种氘代内标在内的184种类二十烷酸。在该液相色谱条件下,同分异构的类二十烷酸11β-PGE₂、PGE₂和PGD₂保留时间分别为1.37、1.27和1.45 min,并且在MRM模式下可以选择不同的子离子进行定量,因此该方法也能对同分异构的类二十烷酸进行分离。

由于类二十烷酸的结构中存在1个羧基,在质谱电离过程中易带负电,因此在LC-MS分析中通常选用负离子模式。为提高检测灵敏度,Bollinger等^[36]使用N-(4-aminomethylphenyl)pyridinium (AMPP)对多种类二十烷酸进行衍生化,使其电荷反转带正电,在ESI⁺模式下进行分析,并与未衍生化的类二十烷酸在ESI^-模式下的分析结果进行对比。在ESI⁺模式下,类二十烷酸的定量限明显低于ESI^-模式下的定量限,约为ESI^-模式下的定量限的1／20。该方法需在LC-MS分析前进行衍生化处理,在进行生物样品分析时,AMPP对不同类型类二十烷酸衍生化的效率可能会影响样品分析的准确性。

Collino等^[37]基于UPLC-Qtrap-MS/MS平台,选用BEH C18色谱柱和乙腈-水体系,对不同年龄段、不同性别的意大利极端长寿人群血清样品中的6种类二十烷酸进行定量分析,发现与年轻人和老年人相比,百岁以上老人血清中的LTE₄、15-HETE和8,9-epoxyeicosatrienoic(8,9-EpETrE)显著升高(p＜0.05),而11,12-dihydroxy-eicosatrienoic acid(11,12-DiHETrE)、9-oxo-octadecadienoic acid(9-oxo-ODE)和9-hydroxy-octadecadienoic acid(9-HODE)显著下降(p＜0.05)。这一结果也支持了脂质、氨基酸和肠道菌群的重构是极端长寿的关键调控过程的假设。

Huang等^[38]基于UPLC-MS平台,对患特应性皮炎的儿童血清样本中类二十烷酸进行代谢组学分析。通过对immunoglobulin E (IgE)高表达组和IgE正常表达组的血清样品进行分析,筛选得到差异代谢物LTB₄和PGs,为特应性皮炎的发病机制和潜在生物标志物的发现提供了参考。Zhang等^[39]基于UPLC-Qtrap-MS/MS平台,选用BEH C18色谱柱和乙腈-水体系,建立了对69种类二十烷酸检出限低、专属性好的分析方法,并应用于补充omega-3多不饱和脂肪酸后小鼠和人血浆中类二十烷酸的代谢组学分析。

EIA法和LC-MS/MS法均是分析类二十烷酸常用的方法。Willey等^[40]分别采用EIA法和LC-MS/MS法对LTB₄进行定量分析。两种方法均具有较好的准确度和精密度,但LC-MS/MS法的线性范围为0.025～25 μg/L,略宽于EIA法(0.025～4 μg/L)。对用EIA法和LC-MS/MS法测定的25位动脉粥样硬化患者的外周血单核细胞中LTB₄含量进行相关性分析,结果表明两种方法的测定结果呈正相关。

Maddipati等^[41]基于HPLC-Qtrap-MS/MS平台,采用C18反相色谱柱和乙腈-水-甲醇体系,对人自然分娩时羊水中的类二十烷酸进行轮廓分析,并首次在人羊水样品中发现了EETs。此外,Maddipati等也对EIA法和LC-MS法分析羊水中类二十烷酸的结果进行了对比,发现EIA法检测到的类二十烷酸的浓度高于LC-MS法检测到的类二十烷酸的浓度,但EIA法在应用于复杂生物样本的检测时易出现假阳性或者高估。因此EIA法和LC-MS法的结合使用有利于复杂生物样本中类二十烷酸灵敏、准确的检测。

类二十烷酸在生物体内氧化途径众多,会产生大量对映异构体。酶氧化生成的类二十烷酸具有高的立体选择性,而非酶氧化生成的类二十烷酸不具有高的立体选择性^[1]。在生物样本中类二十烷酸分析会涉及对对映异构体的分析,液相色谱法是拆分手性化合物的方法之一。

Hong等^[42]基于LC-MS平台,选用商品化的手性色谱柱ChiralPak AD-RH柱,以甲醇-水-乙酸体系对12R-HETE和12S-HETE进行分离,12R-HETE和12S-HETE在13 min内分离。将该方法用于特应性皮炎模型小鼠的12R-HETE和12S-HETE的定量分析,发现12R-HETE和12S-HETE的含量与对照组相比均有显著性增高,有助于了解特应性皮炎的发病机理。Ferreirós等^[43]基于LC-MS平台,选用商品化的Lux Amylose-2手性色谱柱和乙腈-水体系,对两种不同途径生成的异构体LXA₄和15-epi-LXA₄进行分析,并用于人乳腺癌细胞MCF-7培养基中LXA₄和15-epi-LXA₄的验证分析,以避免常规反相色谱分析过程中出现的假阳性结果。

尽管现在已有大量类二十烷酸分析方法的研究,但仍存在很多亟须解决的问题。无论是SPE还是LLE均是类二十烷酸的通用型提取方法,并无针对类二十烷酸特点的特异性提取方法,并且现有的提取方法也不尽相同,没有形成针对不同生物样品的标准提取方法,不同种类类二十烷酸的提取结果差异较大。因此,建立类二十烷酸特异性的提取方法和不同生物样品标准化的提取方法有利于生物样品中类二十烷酸的分析。

由于类二十烷酸中存在大量的对映异构体,现有的正相色谱或反相色谱的手性分离虽然能对部分手性类二十烷酸进行分离,但存在灵敏度较差、液相平衡分离耗时长等不足^[44],因此类二十烷酸的分离分析还需要解决手性分离的问题。

类二十烷酸是不饱和脂肪酸氧化产生的具有生物活性的物质,在人体中发挥着重要作用,并与许多疾病的发生、发展存在密切关系。色谱-质谱联用技术是类二十烷酸分析最强有力的工具,高灵敏度、高选择性、高通量、快速的分析方法的建立为生物样品中类二十烷酸的分析提供了良好的技术平台。随着色谱-质谱联用技术的不断进步,类二十烷酸的分析方法将不断被优化,并在生物标志物的发现、病理机制和药物作用机制等研究中发挥更大的作用。