β-受体激动剂(俗称“瘦肉精”)是一类母核为β-苯乙醇胺结构、具有舒张平滑肌及解除支气管痉挛等作用的药物,在临床上被广泛应用于治疗支气管哮喘^[1]。该类药物能有效促进动物肌肉生长、增加蛋白质含量、减少脂肪沉积、提高瘦肉率,因而被部分养殖户非法用于畜禽饲养^{[2, 3]},导致畜禽肉中该类药物残留严重超标,食用后极易引起头昏、心跳加快、抽搐等急性中毒症状,甚至会危及生命。类似的食品安全事故已频繁发生^{[4, 5]},引起社会广泛关注。为此我国相关部门早已明令^[6]禁止在饲料及畜禽生产中使用苯乙醇胺A等β-受体激动剂,并制定了相应的标准检测方法^[7]和限量标准^[8],但仅限于少数几种β-受体激动剂。少数不法企业为了逃避监管,非法添加日常监测范围以外的新型β-受体激动剂,目前已发现的非法用途的β-受体激动剂已达20多种。因此建立品种覆盖面更广、方法更简便的同时快速测定该类药物的多残留分析手段具有重要意义。

目前用于测定畜禽肉中β-受体激动剂残留的检测方法主要有酶联免疫吸附(ELISA)法^{[9, 10, 11]}、气相色谱(GC)法^[12]、高效液相色谱(HPLC)法^{[13, 14, 15]}、气相色谱-质谱(GC-MS)法^{[16, 17, 18]}以及高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法^{[11, 19, 20, 21, 22, 23, 24]}。由于HPLC-MS/MS具有选择性高、灵敏度高、抗干扰能力强以及样品无需衍生化等优势,已成为该类药物残留分析的最主要手段,然而所报道的文献几乎都选用C18填料的色谱柱,对结构相近的β-受体激动剂(尤其是同分异构体)的分离效果不甚理想。另外,样品处理通常都包括水解(如酸解或酶解等)及提取净化步骤,其提取净化方法主要有液-液萃取^[20]、基质分散固相萃取^[21]、凝胶色谱结合固相萃取^[22]、分子印迹固相萃取^[23]以及QuEChERS^[24]等。前4种方法都用到成本较高的固相萃取柱,非常繁杂耗时,而第5种方法基于分散固相萃取(dSPE)原理,具有简便、快速、廉价且净化效果良好的特点。

本研究针对现有方法存在的前处理复杂、成本高、分离效果较差、可同时测定的药物种类少等问题,采用具有疏水相互作用与π-π相互作用混合模式的新型色谱柱——苯基-己基柱,通过优化样品前处理及色谱-质谱条件,建立了分散固相萃取-同位素稀释-高效液相色谱-串联质谱同时快速测定猪肉中26种β-受体激动剂的方法。该法可同时测定的药物种类覆盖面广(化学结构式见图 1),提取净化效果好,成本低廉,灵敏度高,选择性好。采用同位素内标法定量,有效消除了基质效应,结果准确可靠,为动物源性食品风险监测提供了技术支持。

图1

Fig.1

图1 26种β-受体激动剂的化学结构式 Fig.1 Chemical structures of the 26 β-agonists

Agilent 1200 SL Series RRLC/6410B Triple Quard MS快速高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪(美国Agilent公司);AS 3120超声波发生器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);DC12H水浴式氮吹浓缩仪(上海安谱科学仪器有限公司)。

甲醇及乙腈均为色谱纯(德国Merck公司);β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(活性分别为30 U/mL和60 U/mL,德国Merck公司);甲酸为色谱级(美国Sigma公司);乙酸钠三水合物、乙酸、高氯酸、氢氧化钠及氯化钠均为分析纯(广州化学试剂厂);无水硫酸镁(MgSO₄)为分析纯(上海晶纯生化科技股份有限公司);十八烷基键合硅胶吸附剂(Bondesil-C18)和N-丙基乙二胺吸附剂(Bondesil-PSA)(美国Agilent公司);实验用水为双蒸水。

26种β-受体激动剂标准品:克伦特罗(clenbuterol,CLB)、莱克多巴胺(ractopamine,RTP)、特布他林(terbutaline,TER)、福莫特罗(formo-terol,FMT)、班布特罗(bambuterol,BMT)、沙美特罗(salmeterol,SMT)、丙卡特罗(procaterol,PCT)、异丙肾上腺素(isoprenaline,IPN)、氯丙那林(clorprenaline,CPN)、托特罗定(tolterodine,TOL)及环仑特罗(cycloclenbuterol,CCB)(纯度≥95.0%,购自中国药品生物制品检定所);塞布特罗(cimbuterol,CBT)、利托君(ritodrine,RIT)、妥布特罗(tulobuterol,TUL)、马布特罗(mabuterol,MBT)、齐帕特罗(zilpaterol,ZIL)及苯乙醇胺A(phenylethanolamine A,PEA)(纯度≥98.0%,购自加拿大TRC公司);溴布特罗(brombuterol,BBT)、非诺特罗(fenoterol,FNT)、克仑潘特(clenpenterol,CPT)及克伦丙罗(clenproperol,CLP)(纯度≥97.0%,购自德国Dr.Ehrenstorfer公司);沙丁胺醇(salbutemol,SBT)、西马特罗(cimaterol,CMT)、马喷特罗(mapenterol,MPT)及异舒普林(isoxsuprine,IXP)(纯度≥97.0%,购自美国Sigma公司);喷布特罗(penbutolol,PBT)(纯度为99.5%,购自欧洲药典委员会);克伦特罗-d₉(clenbuterol-d₉,CLB-d₉)及沙丁胺醇-d₃(salbutemol-d₃,SBT-d₃)(纯度≥98.0%,购自加拿大CDN公司)。

Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)、Poroshell 120 Bonus-RP柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)、Poroshell 120 PFP柱(100 mm×2.1 mm,4.0 μm)和Poroshell 120 Phenyl-Hexyl柱(100 mm×2.1 mm,4.0 μm)均购自美国Agilent公司;CORTECS C18+柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)购自美国Waters公司。

单标准储备液:准确称取适量的β-受体激动剂标准品及同位素内标(CLB-d₉及SBT-d₃),用甲醇分别配制成质量浓度为100 mg/L的单标准储备液。置于棕色瓶中,保存于-20 ℃。

混合标准中间储备液:根据需要,将待测物标准储备液用甲醇稀释成质量浓度为1～10 mg/L的混合标准中间储备液。置于棕色瓶中,保存于-20 ℃。

混合内标中间储备液:用0.2%(体积分数)甲酸水-乙腈(90∶10,v/v)溶液稀释同位素内标标准储备液,配制成质量浓度均为200 μg/L的CLB-d₉和SBT-d₃混合内标中间储备液,置于棕色瓶中,保存于4 ℃。

混合标准工作溶液:使用前根据需要吸取一定量的混合标准中间储备液和混合内标中间储备液,用0.2%(体积分数)甲酸水-乙腈(90∶10,v/v)溶液稀释成适当浓度的混合标准工作液,该溶液中CLB-d₉和SBT-d₃的质量浓度均为10 μg/L。

准确称取匀质试样2.0 g,置于50 mL聚丙烯离心管中,加入10 mL 0.2 mol/L乙酸钠缓冲溶液(称取13.6 g乙酸钠三水合物,溶于500 mL水中,用适量乙酸调pH至5.2),涡旋混匀,加入100 μL混合内标中间储备液及50 μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,涡旋5 min后,放置在37 ℃恒温箱内酶解12 h。

酶解后取出,涡旋混匀,以10 000 r/min的速度离心10 min,准确移取5 mL上清液置于15 mL聚丙烯离心管中,加3～5滴高氯酸沉淀蛋白质,涡旋混匀。以10 000 r/min的速度离心5 min,将上清液全部转移至50 mL聚丙烯离心管中,用10 mol/L NaOH溶液调pH值至9。加入2.0 g NaCl及8 mL乙腈,涡旋提取5 min,以5 000 r/min的速度离心5 min,将有机相全部转移至15 mL聚丙烯离心管中,待净化。

在待净化样液中加入净化剂(内含1 000 mg无水硫酸镁、200 mg Bondesil-C18及100 mg Bondesil-PSA),涡旋1 min混匀,静置10 min,以5 000 r/min的速度离心5 min。将上清液全部转移至梨形瓶中,40 ℃水浴下氮吹浓缩至干,准确加入1 mL 0.2%(体积分数)甲酸水-乙腈(90∶10,v/v)溶液,超声30 s溶解残渣,混匀,过0.22 μm滤膜,滤液供LC-MS/MS分析。

色谱柱:Poroshell 120 Phenyl-Hexyl柱(100 mm×2.1 mm,4.0 μm);流动相A: 0.2%(体积分数)甲酸水溶液;流动相B:乙腈;流速:0.3 mL/min;进样体积:5 μL;柱温:30 ℃。梯度洗脱程序:0～2.0 min,3%B;2.0～5.0 min,3%B～5%B;5.0～8.0 min,5%B～12%B;8.0～12.0 min,12%B;12.0～13.0 min,12%B～15%B;13.0～17.0 min,15%B;17.0～18.0 min,15%B～18%B;18.0～20.0 min,18%B;20.0～21.0 min,18%B～25% B;21.0～22.0 min,25%B～30%B;22.0～25.0 min,30%B～40%B;25.0～26.0 min,40%B;26.0～26.1 min,40%B～3%B;26.1～30.0 min,3%B。

离子源:电喷雾离子(ESI)源;扫描方式:正离子;采集方式:多反应监测(MRM);雾化气压力:276 kPa;干燥气流速:11.0 L/min;干燥气温度:350 ℃;毛细管电压:4 000 V;两个四极杆分析器(MS1及MS2)的分辨率:Unit。待测物的质谱参数见表 1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 26种β-受体激动剂的质谱参数 Table 1 MS parameters of the 26 β-agonists No. Drug name Abbreviation Retention time/min Parent ion (m/z) Product ions (m/z) Fragmentor/ V Collision energy/V 1 cimaterol(西马特罗) CMT 4.2 202.1 160.1*, 143.1 130 12, 20 2 isoprenaline(异丙肾上腺素) IPN 2.0 212.1 152.1*, 107.1 93 16, 28 3 clorprenaline(氯丙那林) CPN 11.2 214.1 154.0*, 118.0 85 16, 28 4 terbutaline(特布他林) TER 3.7 226.1 152.1*, 107.0 88 12, 32 5 tulobuterol(妥布特罗) TUL 13.7 228.1 154.1*, 118.1 83 16, 32 6 cimbuterol(塞布特罗) CBT 7.3 234.2 160.1*, 143.1 86 12, 24 7 salbutemol(沙丁胺醇) SBT 3.4 240.2 148.1*, 222.1 96 16, 4 8 zilpaterol(齐帕特罗) ZIL 4.8 262.2 244.1*, 185.0 73 8, 24 9 clenproperol(克伦丙罗) CLP 11.5 263.1 245.0*, 132.1 76 8, 28 10 clenbuterol(克伦特罗) CLB 14.3 277.1 168.0*, 132.1 100 32, 28 11 ritodrine(利托君) RIT 9.6 288.2 121.1*, 150.1 99 20, 16 12 cycloclenbuterol(环仑特罗) CCB 9.6 289.1 121.0*, 150.1 120 20, 16 13 procaterol(丙卡特罗) PCT 18.7 291.2 168.1*, 132.1 98 32, 32 14 penbutolol(喷布特罗) PBT 26.4 292.2 201.1*, 133.1 95 20, 24 15 ractopamine(莱克多巴胺) RTP 13.0 302.2 164.0*, 107.1 100 15, 32 16 isoxsuprine(异舒普林) IXP 20.0 302.2 107.1*, 150.2 104 32, 20 17 fenoterol(非诺特罗) FNT 9.4 304.2 107.1*, 135.1 116 36, 16 18 mabuterol(马布特罗) MBT 17.9 311.1 217.0*, 202.1 94 24, 36 19 mapenterol(马喷特罗) MPT 22.7 325.1 237.1*, 217.1 106 16, 28 20 tolterodine(托特罗定) TOL 26.0 326.2 147.1*, 197.1 135 28, 28 21 clenpenterol(克仑潘特) CPT 22.7 327.1 239.0*, 219.0 140 16, 24 22 formoterol(福莫特罗) FMT 16.7 345.2 149.1*, 121.0 102 16, 40 23 phenylethanolamine A(苯乙醇胺A) PEA 25.4 345.2 150.1*, 121.0 100 20, 40 24 brombuterol(溴布特罗) BBT 17.5 367.0 292.9*, 214.0 114 16, 32 25 bambuterol(班布特罗) BMT 20.2 368.2 72.1*, 294.1 115 40, 16 26 salmeterol(沙美特罗) SMT 26.6 416.3 380.3*, 232.2 130 16, 20 27 clenbuterol-d9(克伦特罗-d9) CLB-d9 14.3 286.1 204.1* 100 12 28 salbutemol-d3(沙丁胺醇-d3) SBT-d3 3.4 243.1 151.1* 100 15 * Quantitative ion.

表1 26种β-受体激动剂的质谱参数 Table 1 MS parameters of the 26 β-agonists

取样品溶液和混合标准工作溶液各5.0 μL进行HPLC-MS/MS测定,以待测物色谱峰保留时间和2对MRM离子对为依据进行定性检测。按内标法计算待测物含量,IPN、SBT、TER、CMT、ZIL、CBT、FNT、RIT、CCB、CPN及CLP这11种待测物以SBT-d₃为内标物,其余15种待测物以CLB-d₉为内标物。

由于β-受体激动剂均有胺类结构,部分还具有1,2-苯二酚(儿茶酚)官能团,属于极性较强的化合物,因此适合采用ESI源进行离子化。将1.0 mg/L的26种β-受体激动剂类药物混合标准溶液注入电喷雾离子源,分别进行正离子模式和负离子模式的全扫描分析,所有化合物响应最好的准分子离子峰均在正离子模式下获得,其母离子均为[M+H]⁺。在此基础上,通过选择离子监测方式分别对每个化合物的碎裂电压进行优化,使得母离子的响应最大。然后对母离子采用子离子全扫描方式分析,通过调整碰撞能量使得目标碎片离子的响应最大。根据欧盟发布的2002/657/EC决议^[25],质谱相关分析方法必须满足鉴定分值不少于4分的规定,1个母离子的分值计1分,1个子离子的分值计1.5分。因此为每个待测物选取2对最具特征且响应最高的MRM离子对(包括1个母离子及2个不同的子离子,共计4分)及相应的仪器参数作为最终的质谱采集参数(见表 1)。

本研究中色谱条件的优化主要考虑的是在尽可能短的时间内实现结构相近化合物(尤其是同分异构体)的分离,同时考虑最大限度地增强部分极性较大的苯二酚型化合物(如IPN等)及苯酚型化合物(如SBT等)的保留,减少因化合物弱保留而可能存在的强基质效应。

β-受体激动剂是在β-苯乙醇胺基本结构基础上修饰得到的系列化合物,结构相近,分离难度大。为在短时间内实现最大程度的色谱分离,本文比较了Poroshell 120 EC-C18、Poroshell 120 Bonus-RP、Poroshell 120 PFP、Poroshell 120 Phenyl-Hexyl及CORTECS C18+等5款不同类型的色谱柱。

结果显示,在相同的流动相组成条件下,Poroshell 120 PFP和CORTECS C18+两款色谱柱对较强极性化合物的保留较弱,不适用于分析β-受体激动剂类药物;Poroshell 120 Bonus-RP色谱柱分离出来的峰明显少于剩余的两款;Poroshell 120 EC-C18及Poroshell 120 Phenyl-Hexyl两款色谱柱所能分离的色谱峰最多,前者能很好地将弱极性化合物分离,但对于中间保留时间部分的化合物分离能力较弱；而后者明显对β-受体激动剂类药物有最佳的选择性,峰数多,且峰形良好。可能是因为键合了苯基-己基填料的色谱柱除了具有与C18填料色谱柱相类似的疏水相互作用外,其苯基与β-受体激动剂上的苯环还存在π-π相互作用,两种分离模式协同作用,从而改善了色谱分离度及其峰形。因此选择Poroshell 120 Phenyl-Hexyl色谱柱作为本方法的分析柱。

由于β-受体激动剂类化合物的质谱采集参数均在ESI源正离子模式下获得,因此为保持足够的质谱检测灵敏度,根据ESI离子化机理,最好在流动相中加入酸性添加剂。在Poroshell 120 Phenyl-Hexyl色谱柱上,考察了0.2%(体积分数)甲酸-乙腈和0.2%(体积分数)甲酸(含10 mmol/L甲酸铵)-乙腈两组不同的流动相对化合物检测的影响。

结果表明,在0.2%(体积分数)甲酸(含10 mmol/L甲酸铵)-乙腈流动相条件下,9～10 min范围内的色谱峰严重堆积,分离度极差,且峰形展宽。试验表明，多次调节梯度洗脱程序后该问题依然存在,这可能是由于甲酸铵的存在导致个别化合物的解离。在无甲酸铵存在的0.2%(体积分数)甲酸-乙腈流动相条件下,通过反复优化梯度洗脱条件,得到的所有色谱峰都是尖锐的窄峰,且峰形对称,大多数化合物的分离度高,几乎都达到了基线分离。图 2为26种β-受体激动剂的总离子流色谱图。

图2

Fig.2

图2 26种β-受体激动剂混合标准溶液的总离子流色谱图 Fig.2 Total ion chromatogram of a mixed standard solution of the 26 β-agonists Peak numbers are the same as those in Table 1.

β-受体激动剂有苯酚型、苯二酚型及苯胺型3种结构类型的化合物,而药物在体内的代谢规律与其化学结构密切相关。有关资料^[1]显示,苯酚型(如RTP、SBT等)化合物在动物体内代谢过程中,易在葡萄糖醛酸转移酶及芳香硫酸酶的作用下发生轭合反应,生成各种结合物,而其他类型的β-受体激动剂则较少发生轭合反应。因此在建立β-受体激动剂药物多残留分析方法时,必须先对样品进行水解,使目标分析物从结合态变成游离态,便于后续提取。常用的可食用动物组织样品的水解方法主要为酸水解法及酶解法,为了比较两者的水解效率,本研究采用实验室能力验证用猪肉样品进行试验,酶解法按照GB/T 22286-2008^[7]的规定进行,而酸水解法除水解部分采用0.1 mol/L高氯酸水解外,其余步骤均与酶解法完全一致。试验结果表明,采用酸水解法对RTP的定量结果约为酶解法的70%。因此为了保证结果的准确性,本研究选用酶水解法。

为了简化提取和净化过程,本文选用乙腈作为提取溶剂,采用dSPE技术进行净化。比较了样液在不同pH条件下,乙腈对待测物的绝对提取回收率,结果见表 2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同pH条件下乙腈对26种β-受体激动剂的提取回收率 Table 2 Extraction recoveries of the 26 β-agonists by acetonitrile with different pH values No. Drug Absolute recoveries/% pH=2 pH=7 pH=9 pH=11 1 CMT 32.6 48.1 69.6 73.2 2 IPN 6.2 18.9 35.2 32.6 3 CPN 23.2 49.8 73.6 72.8 4 TER 8.5 25.3 40.5 41.3 5 TUL 31.2 52.6 86.6 87.6 6 CBT 24.6 46.3 83.6 79.6 7 SBT 10.2 21.3 38.2 37.5 8 ZIL 13.5 30.6 75.6 82.1 9 CLP 37.6 63.5 90.5 88.4 10 CLB 40.3 67.2 89.4 86.3 11 RIT 30.2 56.7 85.6 82.7 12 CCB 31.3 52.1 87.2 89.5 13 PCT 37.3 61.2 92.4 84.9 14 PBT 43.3 70.3 102.3 98.5 15 RTP 36.2 68.2 86.3 90.8 16 IXP 36.3 65.3 87.9 79.8 17 FNT 21.2 35.2 79.8 86.3 18 MBT 36.6 62.2 78.6 82.7 19 MPT 33.6 56.3 85.3 82.6 20 TOL 38.6 69.6 96.4 92.7 21 CPT 32.7 63.1 87.1 90.6 22 FMT 28.9 59.6 90.6 85.6 23 PEA 33.1 53.7 79.6 82.7 24 BBT 29.9 49.6 86.3 85.7 25 BMT 21.8 50.2 80.6 82.4 26 SMT 54.8 72.6 93.2 98.7

表2 不同pH条件下乙腈对26种β-受体激动剂的提取回收率 Table 2 Extraction recoveries of the 26 β-agonists by acetonitrile with different pH values

结果表明,在酸性(pH=2)及中性(pH=7)条件下,乙腈对26种β-受体激动剂的提取率都不理想。由于该类药物具有弱碱性,随着pH值增大,其提取率明显增加,但当pH=9及pH=11时,结果没有太大差异,因此选择在pH=9的样液中进行待测物的提取。对于极性较大的IPN、TER及SBT,在各种pH条件下的绝对回收率均低于其他待测物,但通过同位素稀释法进行校正,其回收率可满足残留分析的要求。

尽管经高氯酸沉淀蛋白质后,已经除去了样液中的大部分杂质,但仍有少量脂肪及色素等干扰物存在,需要进一步净化。C18、PSA及石墨化炭黑(GCB)是常用的dSPE净化吸附剂,其中C18(用量通常为100～300 mg)可以有效去除脂肪杂质,PSA(用量通常为100～300 mg)可以去除有机酸、色素和金属离子。无水硫酸镁(用量通常为500～1 500 mg)主要用于吸收样液中的水分,以保证PSA的吸附能力。为了获得最佳的净化剂用量配比,本研究选取因素A(无水硫酸镁用量)、因素B(Bondesil-C18用量)及因素C(Bondesil-PSA用量)3个因素,每个因素取3个水平,按照L₉(3³)正交表试验,比较10 μg/kg加标浓度水平下各因素组合的回收率和净化效果,以选择最佳组合。正交试验因素水平见表 3。正交试验结果表明,使用1 000 mg MgSO₄、200 mg Bondesil-C18及100 mg Bondesil-PSA组成的净化剂可以获得良好的净化效果。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 净化剂及无水硫酸镁用量配比的正交试验因素水平 Table 3 Orthogonal test factors and levels of the dosages of the purifying agents and MgSO4 Level Factors MgSO4 (A)/mg Bondesil-C18 (B)/mg Bondesil-PSA (C)/mg 1 500 100 100 2 1000 200 200 3 1500 300 300

表3 净化剂及无水硫酸镁用量配比的正交试验因素水平 Table 3 Orthogonal test factors and levels of the dosages of the purifying agents and MgSO4

与其他分析手段不同,质谱分析往往会存在基质效应^[26]。在液相色谱-质谱分析中,客观存在的基质效应会对分析方法的灵敏度、精密度以及准确度造成影响。减少基质效应的方法通常包括稀释样品溶液、增加净化步骤、采用同位素内标物、配制基质匹配标准溶液以及优化色谱-质谱条件等^[27]。

本研究采用同位素稀释内标法,并通过优化色谱分离条件很好地消除了基质效应,同时还减少了样品处理过程中可能带来的误差,有效地保证了定性、定量结果的准确、可靠。

在优化好的色谱-质谱条件下,对6个浓度水平的系列混合标准工作溶液进行测定。26种待测物均以其定量离子对峰面积与相应同位素内标峰面积的比值(y)为纵坐标,以质量浓度(x,μg/L)为横坐标做内标定量工作曲线,获得线性方程。线性相关系数(r²)为0.994 9～0.999 9,表明各待测物在相应的浓度范围内呈良好的线性关系。以S/N＝3确定26种待测物的LOD为0.03～0.3 μg/kg,以S/N＝10确定其LOQ为0.1～1.0 μg/kg(见表 4)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 26种β-受体激动剂的线性范围、线性方程、相关系数(r2)、检出限及定量限 Table 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the 26 β-agonists No. Drug Linear equation Linear range/(μg/L) r2 LOD/(μg/kg) LOQ/(μg/kg) 1 CMT y=0.09645x-0.01942 0.5-50 0.9995 0.1 0.3 2 IPN y=0.08616x+0.00057 0.5-50 0.9999 0.3 1.0 3 CPN y=0.05217x-0.00276 0.5-50 0.9993 0.05 0.2 4 TER y=0.37806x+0.68582 0.5-50 0.9968 0.3 1.0 5 TUL y=0.07079x-0.06088 0.5-50 0.9993 0.05 0.2 6 CBT y=0.06878x-0.08779 0.5-50 0.9995 0.03 0.1 7 SBT y=0.02498x-0.02403 0.5-50 0.9985 0.3 1.0 8 ZIL y=0.10083x-0.14841 0.5-50 0.9989 0.1 0.3 9 CLP y=0.09847x-0.14841 0.5-50 0.9971 0.05 0.2 10 CLB y=0.17352x+0.11717 0.5-50 0.9994 0.05 0.2 11 RIT y=0.08938x-0.11556 0.5-50 0.9993 0.05 0.2 12 CCB y=0.00687x-0.00421 1.0-100 0.9989 0.3 1.0 13 PCT y=0.03698x-0.06795 0.5-50 0.9991 0.1 0.3 14 PBT y=0.05609x+0.04542 0.5-50 0.9993 0.1 0.3 15 RTP y=0.07644x-0.10836 0.5-50 0.9981 0.1 0.3 16 IXP y=0.05273x-0.10238 0.5-50 0.9972 0.1 0.3 17 FNT y=0.12873x+0.06390 1.0-100 0.9984 0.3 1.0 18 MBT y=0.08055x-0.11334 0.5-50 0.9949 0.1 0.3 19 MPT y=0.04025x-0.12195 0.5-50 0.9982 0.1 0.3 20 TOL y=0.03243x+0.03433 0.5-50 0.9995 0.1 0.3 21 CPT y=0.01005x-0.00084 0.5-50 0.9996 0.1 0.3 22 FMT y=0.12805x-0.14095 0.5-50 0.9991 0.1 0.3 23 PEA y=0.07888x+0.04635 0.5-50 0.9991 0.1 0.3 24 BBT y=0.08282x-0.16371 0.5-50 0.9981 0.03 0.1 25 BMT y=0.03148x-0.08511 0.5-50 0.9967 0.1 0.3 26 SMT y=0.02681x+0.02079 0.5-50 0.9993 0.1 0.3 y: peak area ratio of the quantitative ion of the analyte to the internal standard; x: mass concentration (μg/L).

表4 26种β-受体激动剂的线性范围、线性方程、相关系数(r2)、检出限及定量限 Table 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the 26 β-agonists

按前述方法,取阴性猪肉样品,做3个添加水平的加标回收试验,每个水平做6个平行测定,计算每个待测物的平均回收率及相对标准偏差(RSD)(见表 5)。结果显示,方法的平均回收率为65.3%～108.5%,RSD为2.7%～13.3%,准确度和精密度均达到残留检测相关法规要求。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 样品中26种β-受体激动剂的加标回收率和精密度(n=6) Table 5 Spiked recoveries and precisions of the 26 β-agonists in the sample (n=6) Drug Spiked/(μg/kg) Average recovery/% RSD/% Drug Spiked/(μg/kg) Average recovery/% RSD/% CMT 0.5 76.3 11.3 IPN 0.5 78.1 11.9 1.0 83.5 6.9 1.0 92.0 7.2 2.0 93.2 7.8 2.0 90.2 9.6 CPN 0.5 69.5 8.5 TER 0.5 86.1 7.2 1.0 78.2 9.3 1.0 88.6 3.8 2.0 92.4 7.8 2.0 100.2 2.9 TUL 0.5 80.8 9.2 CBT 0.5 87.8 6.7 1.0 92.8 5.9 1.0 96.3 9.4 2.0 91.1 3.7 2.0 94.8 7.8 SBT 0.5 83.9 6.1 ZIL 0.5 94.2 12.2 1.0 92.7 3.1 1.0 105.9 9.8 2.0 95.3 6.2 2.0 97.8 6.3 CLP 0.5 93.4 5.7 CLB 0.5 96.5 7.7 1.0 97.9 2.7 1.0 98.3 8.3 2.0 101.2 3.2 2.0 97.8 6.1 RIT 0.5 79.3 8.9 CCB 1.0 73.8 9.3 1.0 88.6 6.8 2.0 89.8 7.9 2.0 97.4 4.8 5.0 92.6 7.1 PCT 0.5 85.5 6.9 PBT 0.5 68.2 10.3 1.0 93.4 7.6 1.0 79.8 9.7 2.0 99.6 8.9 2.0 82.6 10.3 RTP 0.5 86.3 6.6 IXP 0.5 82.6 9.6 1.0 92.7 8.6 1.0 99.8 8.2 2.0 98.7 6.4 2.0 96.3 9.7 FNT 1.0 69.3 13.3 MBT 0.5 82.6 8.2 2.0 82.8 12.5 1.0 98.4 8.1 5.0 90.2 9.2 2.0 85.7 9.7 MPT 0.5 86.3 4.9 TOL 0.5 70.8 12.1 1.0 98.6 5.9 1.0 86.7 8.4 2.0 96.2 3.8 2.0 82.8 7.6 CPT 0.5 84.3 5.9 FMT 0.5 80.9 8.2 1.0 92.2 7.3 1.0 102.5 9.1 2.0 93.1 4.6 2.0 96.2 6.3 PEA 0.5 102.3 10.6 BBT 0.5 78.6 7.2 1.0 98.8 8.2 1.0 96.5 8.9 2.0 108.5 9.2 2.0 92.2 7.3 BMT 0.5 93.2 5.2 SMT 0.5 65.3 8.3 1.0 105.2 9.1 1.0 78.6 10.2 2.0 96.9 6.9 2.0 86.3 9.1

表5 样品中26种β-受体激动剂的加标回收率和精密度(n=6) Table 5 Spiked recoveries and precisions of the 26 β-agonists in the sample (n=6)

采用本方法对购自3家超市及某农贸市场5家肉档共8批次猪瘦肉样品进行26种β-受体激动剂残留筛查,除购自某农贸市场的1个样品检出PEA外,其余样品的检测结果均为阴性。空白样品及阳性样品的总离子流色谱图见图 3。

图3

Fig.3

图3 (a)空白样品及(b)阳性样品的总离子流色谱图 Fig.3 Total ion chromatograms of (a) a blank sample and (b) the positive sample

本研究建立了分散固相萃取-同位素稀释-高效液相色谱-串联质谱技术同时快速测定猪肉中26种β-受体激动剂残留的新方法。本文在用色谱分离β-受体激动剂时引入具有混合分离模式的苯基-己基色谱柱,获得了传统C18色谱柱难以得到的良好选择性与色谱峰形。此外,在前处理方法上,采用简便快速的分散固相萃取技术代替耗时较多且成本较高的固相萃取净化手段,提高了样品提取净化的效率。与现有方法相比,该方法简化了样品净化步骤,能测定的化合物种类更齐全、覆盖面广,灵敏度高,适用于猪肉产品中β-受体激动剂兽药残留的快速定性筛查及准确定量测定。