邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类常用的塑料增塑剂。PAEs不以化学键形式与产品中的化学物质结合,在一定的条件下容易释放到环境中,造成环境污染。PAEs具有致癌、致畸、致突变作用,可干扰内分泌系统,影响儿童智力发育。近年来PAEs的生殖发育毒性备受关注^{[1, 2]}。PAEs可以通过呼吸、皮肤接触和食物摄入等多种渠道进入体内,并在体内代谢为初级代谢物单酯。长链的PAEs还会进一步发生羟基化和氧化反应,生成二级代谢物^{[3, 4, 5]}。目前PAEs的内暴露主要通过检测尿液中邻苯二甲酸酯代谢物的浓度进行评价^{[6, 7, 8]}。但有研究表明,双酯在尿液中并不能完全代谢为单酯^[3]。因此有必要对单酯和双酯进行分离测定,获得单酯和双酯的数据,以便更准确地评估PAEs的内暴露水平,进行健康风险评价。

目前,邻苯二甲酸双酯的检测方法有GC、GC-MS、HPLC和HPLC-MS等^{[9, 10]},邻苯二甲酸单酯的检测方法主要是HPLC-MS^{[11, 12, 13]}。Blount等^[11]在2000年首次建立了手动固相萃取-HPLC-MS/MS测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物的分析方法。由于邻苯二甲酸单酯带有羧基,极性较强,直接用GC-MS进行分析,灵敏度和分辨率差,一般需衍生后再进行GC-MS分析。常见的衍生化试剂有重氮甲烷、三甲基氯硅烷(TMCS)和N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)等,主要通过甲基衍生、乙基衍生或硅烷化进行处理。Kondo等^[14]采用重氮甲烷衍生邻苯二甲酸单酯后进行GC-MS测定。但在本研究中,如果采用甲基衍生化,邻苯二甲酸单甲酯(MMP)被衍生化为邻苯二甲酸二甲酯(DMP),会干扰MMP和DMP的同时测定;如果采用乙基衍生化,邻苯二甲酸单乙酯(MEP)衍生化为邻苯二甲酸二乙酯(DEP),会干扰MEP和DEP的同时测定。而用硅烷化试剂衍生化后,生成三甲基硅的衍生化产物,可以满足单酯和双酯的同时测定。

同时测定邻苯二甲酸单酯和双酯的研究极少。林兴桃等^[15]建立了HPLC-UV同时测定尿液中邻苯二甲酸单酯和双酯的分析方法。由于HPLC-UV在定性上的局限性,目前的研究更多采用HPLC-MS的方法测定邻苯二甲酸单酯^{[16, 17]}。而GC-MS由于采用毛细管柱,柱效远高于HPLC-MS。利用衍生化试剂和具有独特结构的目标化合物反应,可使其有效地与其他干扰物分离。本研究选择BSTFA作为衍生化试剂,建立了GC-MS同时测定邻苯二甲酸单酯和双酯的分析方法,目前未见相关报道。

Clarus 600气相色谱-质谱联用仪(美国Perkin Elmer公司),Visiprep^TM DL12管防交叉污染固相萃取装置(美国Supelco公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)。

邻苯二甲酸单酯和双酯标准品(纯度均大于97%): DMP、DEP、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBzP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)和邻苯二甲酸单丁酯(MBP)均购自美国Chem Service公司,MMP购自美国Sigma公司,MEP、邻苯二甲酸单苄酯(MBzP)和邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)均购自美国Accu Standard公司。TMCS(纯度大于99%)和BSTFA(纯度为96%)均购自美国Alfa Aesar公司。乙腈(色谱纯,美国Tedia公司),吡啶、正己烷和乙酸乙酯(色谱纯,天津津科精细化工研究所),乙醚和甲酸(分析纯,天津福晨化学试剂厂),磷酸(质量分数为85%)和磷酸二氢钠(分析纯,北京化工厂),β-葡萄糖苷酸酶(140 U/mg,美国Sigma公司)。OASIS HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,美国Waters公司); HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美国Agilent公司)。氮气和氦气(纯度均为99.999%,北京普莱克斯气体有限公司)。实验用水为Milli-Q超纯水器制备的纯净水。所用的玻璃器具洗净后,分别用纯净水、丙酮淋洗,在80 ℃下烘烤2 h,冷却至室温备用。

气相色谱条件:使用HP-5MS毛细管柱;进样口温度为230 ℃;色谱柱初始温度为100 ℃,保持1 min后,以10 ℃/min的速度升温至200 ℃,再以6 ℃/min的速度升至250 ℃,保持3 min。载气为高纯氦气,流速为1.0 mL/min;进样方式为不分流进样;进样量为1.0 μL。

质谱条件:电子轰击(EI)离子源;传输线温度为250 ℃;离子源温度为250 ℃;溶剂延迟时间为5 min;扫描范围为m/z 50～500;定性离子和定量离子见表 1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 邻苯二甲酸单酯衍生物和双酯的定性离子和定量离子 Table 1 Qualitative ions and quantitative ions for phthalate monoester derivatives and phthalate diesters Compound Quantitativeion (m/z) Qualitative ions (m/z) Dimethyl phthalate (DMP) 163 194, 133 Monomethyl phthalate (MMP) 237 163, 221 Diethyl phthalate (DEP) 149 177, 222 Monoethyl phthalate (MEP) 251 223, 149 Monobutyl phthalate (MBP) 223 221, 149 Dibutyl phthalate (DBP) 149 223, 205 Mono (2-ethylhexyl) phthalate 221 223, 149 (MEHP) Monobenzyl phthalate (MBzP) 91 179, 222 Benzylbutyl phthalate (BBzP) 149 91, 206 Di-2-ethylhexyl phthalate (DEHP) 149 167, 279

表1 邻苯二甲酸单酯衍生物和双酯的定性离子和定量离子 Table 1 Qualitative ions and quantitative ions for phthalate monoester derivatives and phthalate diesters

准确称取10种邻苯二甲酸单酯和双酯标样,用乙腈溶解,制备200 mg/L的混合标准储备液。取混合标准储备液,用乙腈稀释为5、10、20、50、100、200、500和1 000 μg/L的系列标准溶液,保存于4 ℃冰箱中。混合系列标准溶液每1至2个月更换1次,或与标准品比较发现有问题立即更换。

准确移取1 mL 5 μg/L的混合标准溶液,氮气吹干后,加20 μL BSTFA和1 μL TMCS,用吡啶定容至100 μL,于30 ℃下衍生化30 min,用GC-MS分析。其他7个浓度的混合标准溶液同上操作,以质量浓度(单位为μg/L)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

尿液的前处理采用固相萃取法。取1.0 mL尿液,加入25 μL β-葡萄糖苷酸酶,摇匀,密封后放入37 ℃水浴中酶解120 min。加入1.0 mL磷酸缓冲液,混匀后过OASIS HLB柱,用2.0 mL 0.1 mol/L甲酸水溶液和1.0 mL水分别淋洗小柱,用2.0 mL乙腈、2.0 mL乙酸乙酯和1.0 mL乙醚-正己烷(1∶19,v/v)分别对小柱进行洗脱。合并洗脱液,高纯氮气吹干后,加20 μL BSTFA和1 μL TMCS,用吡啶定容至100 μL,于30 ℃衍生化30 min,用GC-MS分析。

选择BSTFA作为邻苯二甲酸单酯衍生化试剂,加入适量TMCS加速反应进程,考察了衍生化试剂体积、温度和时间等因素对1 mL 1 mg/L的混合标准溶液衍生化反应的影响。BSTFA的体积对衍生化反应的影响如图 1a所示,随着BSTFA体积的增加,衍生化产物峰面积逐渐上升。当BSTFA体积为20 μL时,大部分衍生物峰面积达到最高值,反应基本完成,因此选择BSTFA体积为20 μL。反应温度对衍生化反应的影响如图 1b所示,不同温度下的衍生物峰面积变化不大,在30 ℃时MMP衍生物峰面积稍高些,因此选择衍生化温度为30 ℃。反应时间对衍生化反应的影响如图 1c所示,随着时间的增加,衍生化产物峰面积逐渐增加,20 min时大部分衍生物峰面积达到最高值,衍生化反应基本完全。但MBzP和MEP的衍生化产物在30 min时稍高于20 min,因此确定衍生化时间为30 min。对衍生化产物的稳定性进行考察,结果如图 1d所示,衍生化产物在3 h内峰面积无明显降低,表明衍生物在3 h内有良好的稳定性。

图1

Fig. 1

图1 不同条件下邻苯二甲酸单酯衍生物的峰面积 Fig.1 Peak areas of phthalate monoester derivatives under different conditions a. peak areas of phthalate monoester derivatives with different volumes of BSTFA (5, 10, 20, 30 and 40 μL) at 30 ℃ for 30 min; b. peak areas of phthalate monoester derivatives with 20 μL BSTFA at different temperatures (20, 30, 40, 50 and 60 ℃) for 30 min; c. peak areas of phthalate monoester derivatives with 20 μL BSTFA at 30 ℃ for different times (5, 10, 20, 30 and 40 min); d. stabilities of phthalate monoester derivatives in 24 h.

综上所述,最佳衍生化条件为:使用20 μL BSTFA在30 ℃下衍生化30 min,衍生化后应在3 h内完成进样分析。

在混合标准溶液中加入BSTFA,在最优条件下进行衍生化反应,按1.2节所述方法进行检测。10种邻苯二甲酸单酯衍生物和双酯得到很好的分离(见图 2)。

图2

Fig. 2

图2 混合标准溶液的总离子流图 Fig.2 Total ion chromatogram of the mixed standard solution

在混合标准溶液中加入BSTFA,进行全扫描确认特征离子。相对强度最大的离子确定为定量离子,10种邻苯二甲酸单酯衍生物和双酯的定性、定量离子如表 1所示。

10种待测物的线性关系如表 2所示,邻苯二甲酸单酯和双酯在5～1 000 μg/L内均具有良好的线性关系。配制低浓度的混合标准溶液,平行试验7次,计算测定结果的标准偏差(S₀),以3S₀为检出限(LOD),10S₀为定量限(LOQ)。邻苯二甲酸单酯和双酯的LOD为0.3～1.1 μg/L,LOQ为1.0～3.7 μg/L,均能满足分析要求。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 邻苯二甲酸单酯和双酯的线性关系、检出限和定量限 Table 2 Linearities, LODs and LOQs of the phthalate monoesters and diesters Compound Linear equation r LOD/(μg/L) LOQ/(μg/L) DMP Y=1359 X+2390 0.9860 0.3 1.0 MMP Y=3184 X-14236 0.9946 0.6 2.0 DEP Y=3215 X-1782 0.9953 0.5 1.7 MEP Y=3088 X-8165 0.9932 1.0 3.3 MBP Y=4719 X-14351 0.9879 1.0 3.3 DBP Y=10306 X-27617 0.9889 0.7 2.3 MEHP Y=11132 X-35578 0.9900 0.9 3.0 MBzP Y=2285 X-6550 0.9806 1.1 3.7 BBzP Y=8192 X-21085 0.9919 0.4 1.3 DEHP Y=6029 X+1363 0.9947 0.6 2.0 Y: peak area; X: mass concentration (μg/L).

表2 邻苯二甲酸单酯和双酯的线性关系、检出限和定量限 Table 2 Linearities, LODs and LOQs of the phthalate monoesters and diesters

在尿液中添加混合标准溶液,进行加标回收率和精密度试验。样品经固相萃取、衍生化处理后用GC-MS分析,平行试验5次,结果见表 3。邻苯二甲酸单酯和双酯回收率为77.9%～97.7%,RSD为3.7%～10.9%,能满足测定要求。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 尿液中邻苯二甲酸单酯和双酯的加标回收率和相对标准偏差(n=5) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of phthalate monoesters and diesters in urine (n=5) Compound Spiked/(μg/L) Measured/(μg/L) Recovery/% RSD/% DMP 100 77.9 77.9 10.2 MMP 100 91.5 91.5 9.1 DEP 100 82.8 82.8 10.7 MEP 100 93.4 93.4 7.2 MBP 100 93.4 93.4 8.6 DBP 100 88.2 88.2 8.3 MEHP 100 90.5 90.5 9.0 MBzP 100 97.7 97.7 3.7 BBzP 100 94.7 94.7 10.9 DEHP 100 92.1 92.1 8.7

表3 尿液中邻苯二甲酸单酯和双酯的加标回收率和相对标准偏差(n=5) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of phthalate monoesters and diesters in urine (n=5)

利用建立的分析方法对50位育龄妇女的尿液进行邻苯二甲酸单酯和双酯的同时测定,图 3为其中1份尿液样品的总离子流图。50份尿液中检出率最高的是DEHP,高达96%;其次是MBP和DBP,检出率均为92%; MEHP、MEP、MBzP和MMP的检出率分别为84%、82%、80%和76%;而DMP、DEP和BBzP在尿液中均未检出。邻苯二甲酸单酯MMP、MEP、MBP、MBzP和MEHP的平均质量浓度分别为14.6、142.7、33.0、16.4和7.4 μg/L,邻苯二甲酸双酯DBP和DEHP的平均质量浓度分别为6.0和12.9 μg/L。

图3

Fig. 3

图3 尿液样品的总离子流图 Fig.3 Total ion chromatogram of a urine sample

本文建立了固相萃取-气相色谱-质谱同时测定尿液中10种邻苯二甲酸单酯和双酯的分析方法。样品采用SPE柱净化,其中的邻苯二甲酸单酯经BSTFA衍生后,用GC-MS检测。该方法检出限低、准确度高,能满足尿液中邻苯二甲酸单酯和双酯同时测定的分析要求,为后续的邻苯二甲酸酯暴露评价奠定了方法学基础。