色谱  2016, Vol. 34 Issue (5): 538-542   PDF (806 KB)    
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石银涛
王绘军
郭璟琦
丁静
王俊伟
超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查血液中10种常见毒物
石银涛, 王绘军, 郭璟琦, 丁静, 王俊伟     
重庆市公安局物证鉴定中心, 重庆 400021
收稿日期: 2016-01-22
基金项目: 重庆市公安局科技攻关计划项目(G2013-04).
通讯联系人: 王俊伟, Tel:(023-)63964387,E-mail:wjwry@tom.com.
摘要: 建立了超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF/MS)快速筛查血液中10种毒物的检测方法。用乙酸乙酯提取血液样品,浓缩至近干后,用甲醇溶解定容,过0.22 μ m滤膜后,直接测定。目标物经ACQUITY UPLC@BEH C18 色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μ m)分离,以甲醇和0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,四极杆飞行时间串联质谱电喷雾正离子模式检测,外标法定量。结果表明:目标物在10.0~500.0 μ g/L范围内线性关系良好,相关系数为0.9908~0.9958,检出限和定量限分别为1.0~2.0 μ g/L和4.0~8.0 μ g/L。在20.0、50.0和200.0 μ g/L 3个添加水平下的平均回收率为56.7%~83.0%, 相对标准偏差为3.6%~8.9%。利用Agilent Mass Hunter PCDL Manager软件建立常见毒物的数据库,并应用于加标样品的筛查分析。该方法能快速筛查出添加的10种常见毒物,检出率达100%,且保留时间偏差均小于0.1 min,质量偏差均小于1 mDa,同位素丰度匹配得分、同位素间距得分和MS匹配得分均大于90, MS/MS图谱匹配得分均大于70。该方法可用于法庭与临床毒物分析。
关键词: 超高效液相色谱     四极杆-飞行时间质谱     快速筛查     毒物     血液    
Rapid screening of 10 drugs in blood using ultra performance liquid chromatography with high resolution quadrupole-time-of-flight mass spectrometry
SHI Yintao, WANG Huijun, GUO Jingqi, DING Jing, WANG Junwei     
Institute of Forensic Science, Public Security Department of Chongqing, Chongqing 400021, China
Received: 2016-01-22
Foundation item: Key Science and Technology Program of Chongqing City Public Security Bureau (No. G2013-04).
Abstract: A high-throughput method was developed for rapid screening of 10 drugs in blood by ultra performance liquid chromatography with high resolution quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS). The sample was extracted by ethyl acetate, the extraction solution was concentrated to near dryness, and dissolved with methanol. Then the sample was passed through a 0.22 μ m membrane. The separation of the 10 target compounds was performed on a Waters ACQUITY UPLC@BEH C18 column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μ m) with gradient elution using methanol and 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution as mobile phases, and analyzed by UPLC-Q-TOF/MS under electrospray ionization (ESI) mode with scanning range of m/z 50-1000. Rapid screening can be achieved using MS matching scores, deviation of retention time, measured mass, isotopic abundance matching scores, isotope spacing match scores and MS/MS matching scores. Good linearities were observed in the range of 10.0-500.0 μ g/L with the correlation coefficients from 0.9908 to 0.9958. The limits of detection and the limits of quantification were 1.0-2.0 μ g/L and 4.0-8.0 μ g/L, respectively. The spiked recoveries were 56.7%-83.0% with the relative standard deviations of 3.6%-8.9%. The result screening database was built using Agilent Mass Hunter PCDL Manager software and then used for the analysis of spiked samples. MS matching scores, isotopic abundance matching scores, isotope spacing matching scores (all > 90 points) and MS/MS matching scores (> 70 points) were applied to identify the drugs. The results showed that all the spiked drugs could be correctly identified with low deviations of retention time (< 0.1 min) and mass (< 1 mDa). The developed method is suitable for the screening and confirmation of the drugs in forensic and clinical analytical toxicology.
Key words: ultra performance liquid chromatography (UPLC)     quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (Q-TOF/MS)     rapid screening     drugs     blood    

在法庭科学毒物分析领域中,由于毒物的种类繁多、性质特殊、分析目的不明确、分析方法多变,很难做到针对性地对毒物进行检验,因此开展常见毒物的快速筛查具有重要意义。

根据本鉴定中心对重庆地区近年来毒物检验结果的数据统计,检测到的常见毒物有氧化乐果、乐果、敌敌畏、呋喃丹、安定、舒乐安定、阿普唑仑、三唑仑、氯丙嗪和异丙嗪等。其中氧化乐果、乐果、敌敌畏、呋喃丹属于农药类毒物,具有不溶或难溶于水、易溶或可溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂的性质,毒性较大,给人、畜的生命安全带来隐患;安定、舒乐安定、阿普唑仑、三唑仑、氯丙嗪和异丙嗪属于安眠镇静类毒物,具有极性小、呈碱性、不溶于水、可溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂的性质,有催眠镇静作用,起效快、口服量安全范围大[1, 2],常被不法分子用于投毒、麻醉抢劫及迷奸等违法犯罪行为。

植物性、动物性和保健性食品中农药残留和镇静药物的检测方法有很多[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9],生物检材中常见毒物的检测方法[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21]也有不少,但均是对某一种或某一类毒物的定性、定量分析。

血液中常见毒物的结构和化学性质差异较大,根据每类毒物的化学性质选择不同的前处理和仪器分析方法进行检验,需要耗费大量的检材(具有一次性和有限性的特点)、时间、人力和物力,给日常检验带来不小困难。

以四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF/MS)为代表的高分辨质谱技术具有质量范围广、分辨率高、分析速度快和数据库检索方便等特点,在复杂基质的目标物检测方面具有良好的应用前景[22, 23, 24, 25]。

本文将液液提取技术和UPLC-Q-TOF/MS相结合,通过Q-TOF/MS母离子的精确质量数、保留时间、同位素丰度、同位素间距、二级碎片离子的精确质量数等[23]对血液中氧化乐果、乐果、敌敌畏、呋喃丹、安定、舒乐安定、阿普唑仑、三唑仑、氯丙嗪和异丙嗪10种常见毒物进行快速筛查和确认。该筛查方法不仅保证了结果的准确性和稳定性,还兼顾了方法的实用性和易操作性,为重庆地区常见毒物的检验工作提供参考。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1290-6550超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪，配有Dual Agilent Jet Stream Electrospray Ionization(ESI)源(美国Agilent公司); ML104电子天平(瑞士Mettler Toledo公司); Allegra X-22R Centrifuge型冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)、Direct-Q3型纯水机(美国Millipore公司); KQ3200E超声波清洗器(中国昆山超声仪器有限公司)。

甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醚均为色谱纯(美国TEDIA公司);甲酸为色谱纯(美国ACS公司)。实验用血液样品由重庆市血液中心提供。

氧化乐果、乐果、敌敌畏、呋喃丹、安定、舒乐安定、阿普唑仑、三唑仑、氯丙嗪和异丙嗪标准品均购自美国Sigma公司,纯度均≥98.0%。

准确称取各标准品10.0 mg,分别置于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,于-18 ℃下避光保存,使用时根据需要用甲醇稀释配制成不同质量浓度的单标准溶液和混合标准溶液。

1.2 样品前处理

取1.0 mL血液于15 mL具塞离心管中,加入5 mL乙酸乙酯,涡旋混匀后,超声5 min,以9 500 r/min离心5 min,取上清液至15 mL具塞离心管;用饱和Na2CO3溶液溶解残渣并调节pH至10,加入5 mL乙酸乙酯,涡旋混匀后,超声5 min,以9 500 r/min离心5 min,取上清液至15 mL具塞离心管中;合并上述中性和碱性提取液,用氮气吹至近干;用甲醇定容至0.5 mL,过0.22 μm有机滤膜,滤液供UPLC-Q-TOF/MS分析。

1.3 液相色谱条件

Waters ACQUITY UPLC@BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱温:35 ℃;进样量:2 μL。流动相:A为甲醇,B为0.1%(v/v)甲酸水溶液;梯度洗脱程序:0～1.0 min,90%B～80%B; 1.0～7.0 min,80%B～10%B; 7.0～9.0 min,10%B; 9.0～9.1 min,10%B～90%B; 9.1～12.0 min,90%B；流速:0.4 mL/min。

1.4 Q-TOF/MS条件

Q-TOF/MS条件、数据采集和数据处理见参考文献[23]。

2 结果与讨论
2.1 UPLC-Q-TOF/MS条件的选择

在UPLC-Q-TOF/MS分离中,流动相的组成和添加剂的种类直接影响目标物的峰形、保留时间和响应强度。本研究考察了0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇、水-甲醇、0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、水-乙腈对分离含有100.0 μg/L氧化乐果、乐果、敌敌畏、呋喃丹、安定、舒乐安定、阿普唑仑、三唑仑、氯丙嗪、异丙嗪的混合标准溶液的影响。结果表明：当用乙腈和甲醇作为流动相中的有机相时,乙腈的洗脱能力更强,目标物出峰时间较早,易受杂质干扰,分离效果不如甲醇好。当水作为流动相的水相时,各化合物峰形和重现性均较差,响应强度较弱;当使用0.1%(v/v)甲酸水溶液时,各化合物峰形对称,重现性好,响应强度明显增加。因此本实验选择0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇作为流动相。通过优化实验,改变不同时间段流动相中有机相和水相(含0.1%(v/v)甲酸)的比例,确定了最佳梯度洗脱条件,10种目标物混合标准溶液(100.0 μg/L)的色谱图如图 1所示。

图1 10种目标物混合标准溶液(100.0 μg/L)的色谱图 Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solutionof the 10 analytes (100 μg/L) 1. dichlorvos; 2. omethoate; 3. dimethoate; 4. carbofuran; 5. promethazine; 6. diazepam; 7. chlorpromazine; 8. estazolam; 9. alprazolam; 10. triazolam.
2.2 样品前处理条件的优化
2.2.1 提取溶剂的选择

本实验考察了二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚作为提取溶剂时,10种常见毒物的回收率(见表 1)。取血样1.0 mL,加入0.1 mL 1 mg/L的混合标准溶液,分成3组,每组6份,分别加入5 mL二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚,按1.2节处理后,UPLC-Q-TOF/MS分析。结果表明:当乙酸乙酯和二氯甲烷为提取溶剂时,目标物的提取回收率均较高且重现性好,明显优于乙醚作为提取溶剂时的回收率,但考虑到二氯甲烷挥发性强、毒性较大、对人体危害大,故本实验最终选择乙酸乙酯作为提取溶剂。

表1 不同提取溶剂提取加标血液中10种目标物的平均回收率和相对标准偏差(n=6) Table 1 Average recoveries and RSDs of the 10 analytesspiked in blank blood by different extraction solvents (n=6)
2.2.2 超声时间的选择

取血液1.0 mL,加入0.1 mL 1 mg/L的混合标准溶液,考察超声时间为2、5、10 min时,10种目标物的回收率(见表 2)。结果表明：超声时间为2 min时,提取回收率偏低;超声时间为5 min和10 min时,提取回收率均较高,且差异不大,因此本实验将超声时间设为5 min。

表2 不同超声提取时间下加标血液中10种目标物的平均回收率和相对标准偏差(n=6) Table 2 Average recoveries of the 10 analytes spiked inblank blood by different ultrasonic extraction (UE) time (n=6)
2.3 方法评价
2.3.1 线性关系、检出限和定量限

分别配制质量浓度为10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/L的系列混合标准溶液,以峰面积为纵坐标(Y)、10种常见毒物的质量浓度为横坐标(X,μg/L)作校正曲线。在10.0～500.0 μg/L质量浓度范围内,10种常见毒物的线性关系良好(r＞0.990 8);本实验测得10种常见毒物的检出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)分别为1.0～2.0 μg/L和4.0～8.0 μg/L(见表 3)。乐果、氧化乐果和呋喃丹的定量限比文献[7]报道值低。分别取质量浓度为20.0、50.0、200.0 μg/L 的10种常见毒物的混合标准溶液各6份,按1.2节处理，用UPLC-Q-TOF/MS分析。1天内用相同方法分析6次,测得日内精密度为3.5%～5.6%;连续测定3天,测得日间精密度为4.3%～8.4%。说明该混合标准溶液在选定时间内稳定性良好。

表3 10种目标物的回归方程、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 3 Regression equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the 10 analytes
2.3.2 回收率和精密度

取空白血样1.0 mL,分别加入质量浓度为20.0、50.0、200.0 μg/L的混合标准溶液各6份,按1.2节处理。10种常见毒物的平均回收率为56.7%～83.0%,相对标准偏差为3.6%～8.9%(见表 4)。

表4 不同加标水平下10种目标物在血液中的平均回收率和相对标准偏差(n=6) Table 4 Average recoveries and RSDs of the 10 analytes spiked in blood with different levels (n=6)
2.3.3 数据库的建立及筛查

利用Agilent Mass Hunter PCDL Manager软件建立目标物数据库。该数据库包括目标物的名称、分子式、保留时间、精确质量数、不同碰撞能量下的二级质谱图。通过实际测定样品的碎片离子信息的谱图与建立的目标物数据库中碎片离子信息进行比对给出镜像对比结果,从而实现对目标物的定性确认[23]。

利用建立的数据库对血液样品添加标准品进行检验,结合样品采集的精确质量数、保留时间、同位素丰度、同位素间距以及不同碰撞能量下的碎片离子信息等信息,通过软件进行自动检索对加标样品进行快速筛查和确认[23]。在设定的筛查条件下,添加的目标物能全部被检测出(见表 5)。保留时间偏差均小于0.1 min,质量偏差小于1 mDa,MS匹配得分、同位素丰度匹配得分和同位素间距得分均大于90; 10种常见毒物的MS/MS匹配得分均大于70,达到70分的确认标准[26]。

表5 利用Agilent Mass Hunter PCDL Manager软件对加标血液中10种目标物的筛查结果 Table 5 Screening results of the ten analytes spiked in blood using Agilent Mass Hunter PCDL Manager software

舒乐安定的镜像对比图如图 2所示,血液加标样品中测得的谱图和标准谱图匹配度较高,进一步确认了舒乐安定的存在。

图2 血液加标样品中舒乐安定的碎片离子镜像信息对比图 Fig.2 Comparison of the spectral difference of estazolam spiked in blood
2.4 实际样品分析

利用该研究建立的目标物数据库及快速筛查方法对近期发生的一起毒化案件样品进行了测定。案例如下:某区居民张某,男,32岁,2015年10月在宾馆被麻醉抢劫。取受害人血液,按本文的研究方法进行检验,检出舒乐安定,质量浓度为206.8 μg/L。该结论为案件性质的确定和侦破提供了依据。

3 结论

本文建立了同时测定血液中氧化乐果、乐果、敌敌畏、呋喃丹、安定、舒乐安定、阿普唑仑、三唑仑、氯丙嗪和异丙嗪的UPLC-Q-TOF/MS分析方法。该方法具有快速、准确、分析通量大等优点,经方法学验证,能满足常见毒物的日常检测要求,对司法鉴定、临床诊断和治疗提供可靠的检验依据。

参考文献
[1]Zhang X W. China Criminal Science and Technology: Drug and Poison Test. Beijing: Chinese People's Public Security University Press, 2003 张新威. 中国刑事科学技术大全:毒品和毒物检验. 北京: 中国人民公安大学出版社, 2003
[2]Liao L C, Wang Y J. Forensic Toxicology Analysis. Beijing: People's Medical Press, 2009 廖林川, 王玉瑾. 法医毒物分析. 北京: 人民卫生出版社, 2009
[3]Feo M L, Eljarrat E, Barceló D. J Chromatogr A, 2010, 1217: 2248  
[4]Ding Y P, You J, Lydy M J. Bull Environ Contam Toxicol, 2009, 83(3): 388  
[5]Gerardo M D, Patricia P B, Roberto R G, et al. Talanta, 2014, 118: 277  
[6]Giroud B, Vauchez A, Vulliet E, et al. J Chromatogr A, 2013, 1316: 53  
[7]Yu L, Song W, Lü Y N, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(6): 597 余璐, 宋伟, 吕亚宁, 等. 色谱, 2015, 33(6): 597  
[8]Moreno-González D, Huertas-Pérez J F, García-Campaña A M, et al. Talanta, 2014, 128: 299  
[9]Moreno-González D, Huertas-Pérez J F, García-Campaña A M, et al. Talanta, 2015, 139: 174  
[10]Es'haghi Z, Nezhadali A, Bahar S, et al. J Chromatogr B, 2015, 980: 55  
[11]Mazzarino M, Cesarei L, de la Torre X, et al. J Pharm Biomed Anal, 2016, 117: 47  
[12]Fernández P, González C, Pena M T, et al. Anal Chim Acta, 2013, 767: 88  
[13]Sauve E N, Langødegard M, Ekeberg D, et al. J Chromatogr B, 2012, 883/884: 177
[14]Marchi I, Schappler J, Veuthey J L, et al. J Chromatogr B, 2009, 877(23): 2275  
[15]Wang R, Wang X, Liang C, et al. Forensic Sci Int, 2013, 233(1/2/3): 304
[16]Wang X, Wang R, Zhang Y R, et al. J Chromatogr A, 2012, 1268: 29  
[17]Tian Y, Zhang J J, Lin H, et al. J Pharm Biomed Anal, 2008, 47(4/5): 899
[18]Kalogria E, Pistos C, Panderi I. J Chromatogr B, 2013, 942/943: 158
[19]Vosough M, Iravani N J. Talanta, 2016, 148: 454  
[20]Xiang P, Sun Q R, Shen B H, et al. Forensic Sci Int, 2011, 204(1/2/3): 19
[21]Mostafa A, Medley G, Roberts D M, et al. J Chromatogr B, 2011, 879: 2234  
[22]Broecker S, Herre S, Wüst B, et al. Anal Bioanal Chem, 2011, 400(1): 101  
[23]Shi Y T, Guo J Q, Wang H J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(7): 687 石银涛, 郭璟琦, 王绘军, 等. 色谱, 2014, 32(7): 687  
[24]Shi Y T, Feng B L, Wang H J, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015, 35(4): 605 石银涛, 冯柏霖, 王绘军, 等. 药物分析杂志, 2015, 35(4): 605
[25]Wilkins C L. Trend Anal Chem, 2007, 26(1): 65  
[26]Zhao Z Y, Shi Z H, Kang J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(4): 372 赵志远, 石志红, 康健, 等. 色谱, 2013, 31(4): 372