Hitachi SM-1510扫描电子显微镜(SEM):日本株式会社日立制作所;Vector 22型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR):德国布鲁克光谱仪公司;SDTQ600热重分析仪(TGA):美国TA公司;TM-1901紫外分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司。

1,1,3,3-四甲基胍、4-乙烯基苄氯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、三氟乙酸(TFA)、盐酸胍：北京百灵威科技有限公司;乙腈(ACN):天津康科德科技有限公司;3-(N-吗啉基)丙磺酸(HEPES)：BBI公司;偶氮二异丁腈(AIBN)：天津市科密欧化学试剂有限公司。β-酪蛋白(β-casein)、卵清白蛋白(OVA)、牛血红蛋白(BHb)、细胞色素C(Cyt C)：美国Sigma公司。

研究中以1,1,3,3-四甲基胍和4-乙烯基苄氯为原料合成胍基离子液体功能单体。量取1,1,3,3-四甲基胍12.547 mL(0.1 mol)于100 mL圆底烧瓶中,加入20 mL乙腈,量取14.21 mL(0.1 mol) 4-乙烯基苄氯于滴液漏斗中,逐滴加入到烧瓶中,常温下反应4 h后得白色固体,放置于真空干燥箱中干燥。产物通过FT-IR进行分析。

以胍基离子液体为功能单体,N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,AIBN为引发剂,通过沉淀聚合方法合成聚胍基离子液体聚合物。取胍基功能单体1 mmol于圆底烧瓶中,加入60 mL乙腈溶解,随后加入4 mmol的N,N-亚甲基双丙烯酰胺,超声脱氧5 min后,充氮气,继续加入0.45 mmol AIBN,充氮气除氧后封口,超声3 min,放于60 ℃的水浴锅中反应24 h。反应完成后用蒸馏水洗涤3次、抽滤,放于真空干燥箱中干燥。产物通过FT-IR、SEM、TGA进行分析。

实验考察了聚胍基离子液体材料在不同pH、不同浓度的HEPES-NaOH缓冲液条件下对β-酪蛋白、OVA、BHb、Cyt C的选择性识别与富集能力,并通过公式(1)求出材料对各种蛋白质的吸附量Q(mg/g)。同时考察该材料对β-酪蛋白的吸附动力学和吸附等温线,以评价材料的吸附性能。

称取2.0 mg聚胍基离子液体材料于离心管中,分别加入4.0 mL β-酪蛋白、OVA、BHb、Cyt C标准蛋白质溶液,振荡混匀,4 ℃下静置吸附。材料对每种蛋白质的吸附量通过公式(1)计算得到。24 h后,放于离心机中以14000 r/min离心4 min,移取上清液,用紫外分光光度计(UV)分别在280、280、406、409 nm处检测它们的吸光度值。绘制标准蛋白质浓度-吸光度标准曲线,通过标准曲线方程计算吸附后溶液中蛋白质的浓度。本实验重复3次求平均值。

用HEPES-NaOH缓冲液(pH=6.80,25 mmol/L)配制质量浓度为0.4 mg/mL的β-酪蛋白溶液。称取2.0 mg的聚胍基离子液体材料于编号1～6的离心管中,分别加入4.0 mL 0.4 mg/mL的β-酪蛋白标准溶液,振荡混匀,4 ℃下静置吸附。1～6号分别静置吸附5、10、15、30、60、180 min后,放于14000 r/min离心机中离心4 min,移取上清液,用UV在280 nm处测得上清液中蛋白质的浓度。聚胍基离子液体材料对β-酪蛋白的吸附量通过公式(1)计算得到。

用HEPES-NaOH缓冲液(pH=6.80,25 mmol/L)分别配制质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.30、0.50、0.80、1.0 mg/mL的β-酪蛋白标准溶液。称取2.0 mg聚胍基离子液体材料于编号为7～12的离心管中,分别加入4.0 mL不同质量浓度的β-酪蛋白标准溶液,振荡混匀,于4 ℃下静置吸附。聚胍基离子液体材料对β-酪蛋白的吸附量通过公式(1)计算得到。本实验结果为3次测试的平均值。

通过考察不同类型洗脱剂洗脱聚胍基离子液体材料吸附的磷酸化蛋白,并计算其洗脱效率。该结果有助于:1)寻找最佳的洗脱剂将材料吸附的磷酸化蛋白洗脱下来,用于磷酸化蛋白质组学的进一步研究；2)通过比较不同洗脱剂洗脱蛋白质的能力,结合洗脱剂本身的性质,可以进一步探求材料对磷酸化蛋白的吸附机理。

本实验选取4种洗脱剂来考察不同洗脱剂的洗脱效率。4种洗脱剂如下:(1)47.5%乙腈+2.5%三氟乙酸+50%盐酸-盐酸胍(pH=4.00,500 mmol/L); (2)49.0%乙腈+1.0%三氟乙酸+50%盐酸-盐酸胍(pH=4.00,800 mmol/L); (3)49.0%乙腈+1.0%三氟乙酸+50%盐酸-盐酸胍(pH=4.00,2000 mmol/L); (4)47.5%乙腈+2.5%三氟乙酸+50%盐酸-盐酸胍(pH=4.00,2000 mmol/L)。洗脱效率通过公式(2)来计算。

为了证明胍基离子液体功能单体与聚胍基离子液体材料的结构,我们对两种产物进行了红外光谱分析。图 1为胍基离子液体功能单体和聚胍基离子液体材料的红外光谱图。

从图 1中可看出两种产物的红外光谱图有明显差别,其中图 1a的3448.54 cm^-1与图 1b的3431.95 cm^-1处均属于N-H伸缩振动;图 1a的2924.80 cm^-1与2890.90 cm^-1处与图 1b的2925.39 cm^-1与2854.72 cm^-1均属于CH₃-与CH₂-上的C-H伸缩振动;图 1a的1635.77 cm^-1处属于4-乙烯基苄氯上C=C的伸缩振动;图 1b的1736.86 cm^-1处属于交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺上酰基C=O的伸缩振动;图 1a的1612.28、1420.20、1393.37 cm^-1与图 1b的1601.09、1555.58 、1459.69、1410.27 cm^-1均属于苯环的伸缩振动。

图1

Fig. 1

图1 (a)胍基离子液体与(b)聚胍基离子液体材料的红外光谱 Fig.1 FT-IR spectra of (a) guanidinium ionic liquid functional monomer and (b)poly(guanidinium ionic liquid)s materials

为了考察聚胍基离子液体材料的热稳定性,我们对该材料进行了热重分析。图 2为聚胍基离子液体材料的热重图谱。

图2

Fig. 2

图2 聚胍基离子液体材料的热重图谱 Fig.2 DSC-TGA spectra of poly(guanidinium ionic liquid)s materials DSC: differential scanning calorimeter; TGA: thermal gravity analyzer.

从图 2中可看出86.38 ℃处的下降曲线代表聚合物中水分的蒸发,质量的损失量为18.74%,316.17 ℃处的下降曲线代表聚合物中交联剂C-N的裂解,421.78 ℃处的下降曲线代表聚合物中胍基离子液体功能单体的损失,两次共损失材料的83.02%。

为了考察聚胍基离子液体材料的表面形貌,对该材料进行了SEM测试。图 3为聚胍基离子液体材料的扫描电镜图。

图3

Fig. 3

图3 聚胍基离子液体材料的扫描电镜图 Fig.3 Scanning electron micrograph of poly(guanidiniumionic liquid)s materials

从图 3中可看出,聚胍基离子液体材料颗粒粒径均匀分布在200 nm左右。颗粒出现了团聚现象，可能原因是反应过程中聚合物的交联作用使附近的颗粒交联在一起,产生了团聚效果。

聚胍基离子液体材料的胍基与磷酸化蛋白的磷酸基团之间形成氢键的数量以及稳定性可能受缓冲液pH值和浓度的影响,从而影响材料对蛋白质的选择性结合。因此,我们选取4种缓冲液浓度(10、25、50、100 mmol/L),选取了由弱酸性到碱性的5种pH值(pH=6.80、pH=7.60、pH=8.00、pH=8.80、pH=9.20)考察了材料在不同条件下对不同蛋白质的吸附量。

从图 4中可看出,在所考察条件下β-酪蛋白的吸附量在4种蛋白质中最大,说明材料对β-酪蛋白有选择性识别。BHb的吸附量随着pH的增高而增加,说明溶液的pH对BHb的影响非常大。OVA的吸附量最大达到311 mg/g,Cyt C的吸附量均小于100 mg/g。当缓冲液选取浓度为25 mmol/L、pH=6.8时,β-酪蛋白达到最大吸附量为599.1 mg/g,而其余3种蛋白质的吸附量都小于β-酪蛋白的吸附量,表明该材料能选择性识别β-酪蛋白。

图4

Fig. 4

图4 材料在不同pH、不同浓度HEPES-NaOH缓冲溶液中磷酸化蛋白的吸附量 Fig.4 Adsorption capacity of phosphorylated proteins on poly(guanidine ionic liquid)s in different pH values and different concentrations of HEPES-NaOH

图 5a为聚胍基离子液体材料吸附β-酪蛋白的吸附动力学曲线,图 5b为聚胍基离子液体材料吸附β-酪蛋白的吸附等温曲线。从图 5a中可看出，当吸附1 h 后，材料对β-酪蛋白的吸附达到平衡,吸附量达到599.1 mg/g。从图 5b中可看出，随着β-酪蛋白浓度增加,吸附量也逐渐增加。说明材料对β-酪蛋白具有良好的吸附性能。

图5

Fig. 5

图5 聚胍基离子液体材料吸附β-酪蛋白的(a)吸附动力学曲线和(b)吸附等温曲线 Fig.5 (a)Dynamic adsorption profiles and (b) adsorption isotherm of β-casein on poly(guanidyl ionic liquid)s

为了研究对吸附后蛋白质的回收,分别考察了乙腈、TFA含量、不同浓度的pH 4.0盐酸-盐酸胍缓冲体系对蛋白质洗脱率的影响。结果显示:采用洗脱剂1时,β-酪蛋白的洗脱效率最高,达到89.01%;采用洗脱剂2、3、4时,β-酪蛋白的洗脱效率依次为72.11%、53.09%、51.28%。利用含有高浓度胍基基团的缓冲液洗脱材料时,大量的胍基基团会与材料上的胍基形成竞争吸附,进而洗脱已被材料吸附的β-酪蛋白,达到洗脱的目的;加入TFA水溶液的洗脱原理是:TFA是一种强酸,在含有TFA的水溶液中,胍基和β-酪蛋白均带正电荷,两者之间产生静电排斥作用,使得β-酪蛋白从材料上洗脱下来。虽然洗脱体系中含有pH 4.00的盐酸-盐酸胍缓冲溶液,但是随着洗脱液中TFA浓度越高,则溶液pH值越低,导致胍基和β-酪蛋白带正电荷越明显,静电排斥力越大,β-酪蛋白被洗脱的效率就越高。

本实验成功合成了胍基离子液体单体,并制备了聚胍基离子液体材料,通过FT-IR技术对胍基离子液体进行表征,证明其结构。通过FT-IR、SEM、TGA对聚胍基离子液体材料的结构、形貌、热稳定性进行了分析,并通过吸附实验验证材料的吸附性能。结果表明:聚胍基离子液体材料的颗粒粒径为200 nm左右,在较高的温度下不易分解,热稳定性良好。材料在短时间可对β-酪蛋白具有较大的吸附能力,吸附容量为599.1 mg/g,并可在1 h内达到吸附平衡;蛋白质洗脱效率达到89.01%。