大环内酯类抗生素是利用放线杆菌或者小单孢菌生产的, 具有12~16元碳内酯环结构的广谱抗菌药, 其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体属、衣原体属等病原体具有较强的抑制能力, 广泛应用于防治畜禽的感染性疾病、呼吸道疾病及消化道疾病[1, 2]。虽然大环内酯类抗生素毒性较小, 但如果滥用, 则可能在动物体内产生药物残留并且造成环境污染, 一旦被人体摄入, 一方面可能会引起剧烈的过敏反应, 例如:肠道紊乱、腹泻、呕吐等, 造成人体免疫系统功能降低, 损害人体健康; 另一方面可能使人体产生被迫的抗药性[3, 4]。抗生素残留问题日渐突出, 由此带来的食品安全隐患已经引起国际社会的广泛关注, 国内外都采取了多种措施控制抗生素的滥用[5]。因此, 建立快速、简便、稳定性强、灵敏度高的检测大环内酯类抗生素的方法具有重要意义。
目前, 大环内酯类抗生素的检测方法主要有微生物法[6]、紫外分光光度法[7]、毛细管电泳-电化学法[8]、气相色谱-串联质谱法[9]和液相色谱-串联质谱法[10-17], 其中微生物法、紫外分光光度法、毛细管电泳-电化学法、气相色谱-串联质谱法等存在前处理复杂、灵敏度低、准确度低、检测种类受限制等缺点, 因此研究报道较少, 研究较多的是液相色谱-质谱法, 其前处理方法多为液液萃取法、离线固相萃取法和基质固相分散萃取法[18], 利用在线固相萃取-液相色谱-串联质谱技术对大环内酯类药物残留检测鲜有报道。在线固相萃取是近年来兴起的前处理新技术, 该技术以传统固相萃取原理为基础, 对萃取柱填料进行改良, 利用高效液相色谱多流路技术和多阀切换技术, 实现了固相萃取过程的全自动处理。相比传统的固相萃取技术, 在线固相萃取具有操作简便、稳定性好、检出限低、灵敏度高等优势, 还可以缩短检测时间、节省人力和耗材。目前已有应用于检测农药残留[19]、兽药残留[20, 21]、生物毒素[22]等方面的相关报道。在自动化程度越来越高的形势下, 将在线固相萃取技术与先进的质谱技术结合是检测技术发展的趋势。
本实验采用在线固相萃取-液相色谱-串联质谱法对猪肉中10种大环内酯类药物残留进行检测。利用Spark公司的在线固相萃取装置, 实现了固相萃取过程的自动化, 并对关键的固相萃取参数、液相色谱参数、质谱参数进行了优化, 有效降低了质谱的基质效应, 克服了传统固相萃取稳定性差、操作繁琐、成本高、资源消耗大等缺点。本方法实用性强, 后期可对检测品种进行扩充, 是对抗生素残留检测方法较有意义的研究。
SymbiosisTM在线净化液相色谱(荷兰Spark公司); AB6500串联三重四极杆质谱分析系统配Analyst数据处理软件(美国SCIEX公司); MCX阳离子在线固相萃取小柱(10 mm×1 mm)和HLB在线固相萃取小柱(10 mm×1 mm, 美国Waters公司); C18 HD在线固相萃取小柱(10 mm×1 mm, 荷兰Spark公司); XBridge BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm, 美国Waters公司); Kinetex C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm, 美国Phenomenex公司); Hypersil Gold C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm, 美国Thermo公司); GENIUS 3涡旋混匀器、旋转蒸发仪(美国IKA公司); 高速冷冻离心机(美国Sigma公司)。
10种大环内酯类抗生素标准品泰乐菌素、罗红霉素、阿奇霉素、红霉素、地红霉素、克拉霉素、麦迪霉素、替米考星、吉他霉素以及交沙霉素(纯度均≥92%, Dr. Ehrenstofer公司, 德国); 甲醇、乙腈、正己烷、甲酸(色谱纯, 德国Merck公司); 乙酸铵(色谱纯, 美国Sigma公司); 去离子水(屈臣氏公司); 氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸(分析纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司)。
标准溶液的配制:准确称取10种大环内酯类抗生素适量, 以甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中, 配制成质量浓度为1.0 g/L的标准储备液, 于-20 ℃下保存; 准确吸取100 μL的标准储备液于100 mL容量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 配制成1 mg/L的混合标准工作液, 于-20 ℃下保存。取适量标准工作液, 用阴性样品基质提取液配制成基质标准工作液, 现用现配。
磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L)的配制:准确称取7.1 g磷酸氢二钠, 溶解于400 mL水中, 用磷酸调节至pH 8, 用水定容至500 mL, 现用现配。
准确称取粉碎好的试样5.00 g(精确至0.01 g), 置于50 mL离心管中, 加入乙腈20 mL, 超声提取10 min, 剧烈振荡5 min, 以8000 r/min离心3 min, 取上清液于另一离心管中; 在残渣中再加入乙腈10 mL, 重复提取一次。合并上清液, 加入氯化钠2 g和正己烷20 mL, 涡旋1 min, 以8000 r/min离心3 min, 取乙腈层溶液, 于40 ℃下旋转蒸发至干, 用2 mL磷酸盐缓冲液溶解残渣, 过0.2 μm滤膜后, 准备上机测定。
本实验使用SymbiosisTM在线净化液相色谱实现在线净化和色谱分离, 该设备由在线净化装置和液相色谱两部分组成, 通过若干六通阀实现了在线净化和液相色谱的连接。在线净化和液相色谱分离这两部分是独立运行的, 在线净化完成时, 通过真空泵将洗脱液注入液相色谱, 进行色谱分离。在线固相萃取柱为HLB柱(10 mm×1 mm), 分析色谱柱使用XBridge BEH C18色谱柱, 流动相A为10 mmol/L乙酸铵水溶液, 流动相B为乙腈溶液。柱温设定为40 ℃, 进样量为100 μL。当液相色谱进行梯度洗脱时, 在线净化系统进行下一个样品净化, 大大节约了整体运行时间。在线净化程序见表 1, 色谱分离程序见表 2。
电喷雾离子(ESI)源, 正离子模式; 扫描方式:多反应监测(MRM); 喷雾电压:5 500 V; 雾化器(GS1) 压强: 344.7 kPa; 辅助气(GS2) 压强: 344.7 kPa; 气帘气压强(CUR): 206.8 kPa; 离子源温度(TEM): 550 ℃; 扫描时间:0.05 s。10种目标化合物的定性和定量离子以及对应的碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)见表 3。
为了达到较好的分离效果, 实验选用了XBridge BEH C18柱、Kinetex C18柱、Hypersil Gold C18柱3种色谱柱, 以质量浓度为10 μg/L的10种大环内酯类药物标准品直接注入色谱系统, 不经过固相萃取小柱, 在相同的流动相和相同的液相色谱分离程序(1.2.2节)条件下, 通过考察峰形、分离度等因素选择色谱柱。实验结果表明, 使用XBridge BEH C18色谱柱时, 分析物峰形更尖锐, 10种化合物的峰拖尾情况较少。这可能是由于大环内酯类抗生素中含有叔氨基结构, 与固定相残留硅羟基之间的非特异性相互作用使峰形出现拖尾等变形。使用固定相末端封闭处理的色谱柱, 可以改善峰形。因此, 本实验选用了XBridge BEH C18色谱柱。
实验比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%(体积分数)甲酸水溶液、乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液4种流动相体系。在相同的液相色谱分离程序下, 考察10种化合物的出峰情况。通过比较发现, 乙腈-0.1%(体积分数)甲酸水溶液和乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液2种流动相体系的峰形优于甲醇-水和乙腈-水流动相体系的峰形。这说明在流动相中加入甲酸或者乙酸铵能改善化合物的峰形, 考虑到大环内酯类药物在弱碱性环境下更加稳定, 最终选取了乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相。
通过蠕动泵, 将10种大环内酯类药物标准品(质量浓度为1 mg/L)以10 μL/min的速度直接注入质谱仪中, 将质谱参数设定为气帘气137.9 kPa; 喷雾电压5 500 V; 离子源温度20 ℃; 雾化器压强137.9 kPa; 以全扫描模式确定目标化合物的母离子质量数。结果表明, 10种化合物均能形成[M+H]+的母离子, 而替米考星、罗红霉素、阿奇霉素、地红霉素同时还形成了[M+2H]2+的母离子。对母离子进行二级扫描, 分别确定其定性和定量离子。对子离子的去簇电压、碰撞能量等参数进行优化。经过优化后进行质谱峰强度对比, 4种具有[M+2H]2+母离子物质的[M+2H]2+峰强度均比其对应的[M+H]+的母离子强度小, 最终确定以[M+H]+作为母离子。提取离子色谱图见图 1。
由于实际样品的基质较为复杂, 因此选择合适的固相萃取柱对降低基质效应、提高实验回收率非常重要。实验选取了MCX阳离子柱(10 mm×1 mm)、HLB柱(10 mm×1 mm)和C18 HD柱(10 mm×1 mm)等3种在线固相萃取小柱, 比较10种大环内酯类药物标准溶液(质量浓度为10 μg/L)的峰面积。在1.2.2节条件下(使用MCX阳离子小柱时, 洗脱溶液为2%(体积分数)的氨水甲醇溶液, 其余条件不变), 通过比较标准品的峰面积大小, 来选择合适的固相萃取小柱。实验表明, 10种大环内酯类药物在MCX柱上几乎没有保留, 因此首先排除MCX柱。对于HLB柱和C18 HD柱, 考察了40%、50%、60%、70% 4种不同体积分数甲醇淋洗液下的出峰情况, 随着淋洗液中甲醇比例的增大, 目标物质峰面积逐渐变小, 而使用HLB柱进行实验时发现, 峰面积下降速度较C18 HD柱慢。这说明HLB柱可以承受更高比例的有机溶剂淋洗, 可以获得更好的净化效果。综合考虑, 最终确定以HLB柱作为固相萃取小柱。
洗脱液体积直接影响着回收率的高低和色谱峰形。在上样量一定(100 μL)及洗脱速度一定(100 μL/min)的条件下, 本实验选取了洗脱液为100、150、200、250、300 μL进行试验, 以10种目标化合物标准溶液(质量浓度为10 μg/L)的峰面积考察洗脱效果。10种化合物峰面积变化情况如图 2所示, 随着洗脱液用量的逐渐增大, 目标化合物的峰面积逐渐增加, 当洗脱液达到250 μL后, 峰面积变化不明显, 因此, 本实验选择洗脱液体积为250 μL。
本实验中洗脱液采用该系统的聚焦模式(Focusing HPD)直接注入色谱柱入口处, 由于进样量较大, 需要选择合适的洗脱速度, 以保证洗脱效果。整个进样过程持续2.5 min, 在此过程中需要改变流动相的速度, 使洗脱速度和流动相速度之和保持一定, 避免由于瞬间总体速度变化快而导致压力波动较大, 造成出峰异常。此外, 由于洗脱液为高浓度有机相, 为了使洗脱液在色谱柱入口处产生聚集效应, 应该同时使流动相保持高含量水相(98%, 体积分数), 在洗脱溶剂量一定的情况下(250 μL), 本实验选取了50、100、200 μL/min进行试验。结果发现, 洗脱速度为50 μL/min时, 色谱出峰峰形较差, 峰宽较大且出现拖尾, 这可能是由于洗脱时间较长(5 min), 洗脱液在色谱柱柱头产生扩散, 导致峰形异常。当洗脱速度为100 μL/min和200 μL/min时, 峰形正常, 但洗脱速度为200 μL/min时峰面积变小。综合考虑, 本实验选取洗脱速度为100 μL/min。
由于猪肉基质较为复杂, 目标化合物虽然经过在线固相萃取净化, 但仍然有基质效应存在。因此, 需要对基质效应进行评价。本实验将10种大环内酯类抗生素标准品用甲醇配制成10 μg/L的标准溶液, 再按照1.2.1节预处理方法制备出猪肉空白基质, 用空白基质配制成质量浓度为10 μg/L的10种大环内酯类抗生素的混合标准液。以1.2.2节方式进样, 以空白基质中标准物质的峰面积(A)和甲醇中标准物质的峰面积(B)的比值考察基质效应的大小, 基质效应被定义为A/B×100%。结果如表 4所示, 基质效应值从80.9%到97.8%, 基质效应影响较小。这表明, 利用该在线固相萃取技术, 有效地去除了杂质的干扰, 降低了基质效应。
采用空白基质配制一系列的标准工作液, 以10种大环内酯类药物的定量离子峰面积为纵坐标, 相应的质量浓度(μg/L)为横坐标, 进行线性回归计算, 得到线性方程、线性范围和相关系数; 以信噪比(S/N)≥3确定检出限(LOD), S/N≥10确定定量限(LOQ)。结果如表 5所示, 方法在0.1~200 μg/L范围内线性关系良好, 线性相关系数(R2)＞0.990。
在空白基质中添加10种大环内酯类药物, 添加水平分别为1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ, 制成阳性样品, 进行前处理, 每个添加水平平行测定6次, 计算回收率及其相对标准偏差(RSD), 结果见表 6。由表 6可知, 回收率范围为69.6%~115.2%, RSD范围为0.9%~9.2%。结果表明, 该方法能够满足实际样品的检测需要。
应用本方法对从本地大型超市、农贸市场中购置的15批次猪肉进行了检测, 其中1个样品检出了红霉素, 含量为15.2 μg/kg, 其余样品均没有检出上述10种大环内酯类抗生素。对阳性样品使用国标方法GB/T 20762-2006《禽肉中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素、交沙霉素残留量的测定液相色谱-质谱法》进行了复检, 检出红霉素含量为14.8 μg/kg, 与本方法结果吻合。
本文利用在线固相萃取-液相色谱-质谱联用技术, 建立了猪肉中10种大环内酯类抗生素的检测方法, 并进行了方法学的验证。与传统固相萃取技术相比, 该方法更加简便、经济、高效, 能够满足日常大批量检测的需求, 是对现有的检测大环内酯类药物方法的有益补充。
2017,
Vol. 35 Issue (10): 1055-1061
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