胍基乙酸又称乙酸胍或胍乙酸(guanidinoacetic acid, GAA), 作为肌酸的前体物在动物机体内天然存在(结构式见图 1)。研究发现在饲料中添加胍基乙酸能有效提高畜禽的增重速度, 显著提高饲料转化率[1-3]。目前胍基乙酸作为新型饲料添加剂已被欧盟和我国批准使用[4-6], 推荐用量为600 mg/kg, 最高限量为1 200 mg/kg。为确保胍基乙酸的合理使用和饲料安全, 有必要对饲料中胍基乙酸的含量进行监测和控制。
目前, 有关胍基乙酸的测定方法多为反相液相色谱法[7-10]。李秀瑜等[7]建立了同时检测胍基乙酸、氨基乙酸和单氰胺的紫外检测-液相色谱法, 用于胍基乙酸的产品质量控制以及生产过程监控。Buchberger等[9]使用茚三酮柱前衍生-荧光检测法测定了血样中的5种胍基化合物。Kandhro等[10]以吡咯酮作为衍生试剂, 建立了用于测定尿毒症患者血清中胍基化合物的紫外检测-液相色谱法。胍基乙酸极性较高, 在反相色谱柱上保留时间较短[7], 直接测定法很难实现复杂基质如饲料的高效分离。应用较多的柱前衍生法[8-10]主要集中于生物样品的测定, 方法灵敏度较高, 但衍生步骤繁琐, 易受外部条件干扰。
胍基乙酸属于有机弱酸, 同时含有单氰胺, 既可带正电荷又可带负电荷, 其结构特性适合使用离子交换模式进行检测。离子色谱法具有简单快速、选择性好、环境友好等特点, 除电导检测器[11, 12]和脉冲安培检测器[13]外, 随着与紫外检测器、质谱检测器、柱后衍生等联用方法的加入, 离子色谱法的应用范围已扩展到环境[14]、食品[15]、制药[16]等领域。然而, 目前尚未见离子色谱法应用于胍基乙酸检测的报道。本文对比柱前衍生法, 通过对色谱柱选择、流动相洗脱、样品前处理等条件进行优化, 建立了一种检测饲料中胍基乙酸含量的离子色谱法。
高效液相色谱仪带荧光检测器(美国Agilent公司); 离子色谱仪带紫外检测器(美国Thermo Fisher公司); Dionex IonPacTM CS16阳离子交换柱(250 mm×5.0 mm, 美国Thermo Fisher公司); Symmetry C18分析柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国Agilent公司); KQ5200超声波清洗器(昆山舒美公司); 超纯水仪(美国Millipore公司); 分析天平(美国Sartius公司); 高速离心机(美国Sigma公司)。
胍基乙酸(纯度≥98%)和甲磺酸(纯度≥99%)购自美国Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯。
100 mmol/L甲磺酸水溶液:准确称取9.62 g甲磺酸, 用超纯水溶解, 定容至1 L, 摇匀, 用0.45 μm水相滤膜过滤, 备用。
胍基乙酸标准贮备溶液:准确称取50 mg(精确至0.01 mg)胍基乙酸标准品, 加60 mL超纯水, 超声溶解后定容至100 mL, 配制为500 mg/L的胍基乙酸标准储备溶液, 置于4 ℃冰箱保存, 保存期1个月。
胍基乙酸标准工作溶液:分别精确移取0.10、0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、10.00、20.00和40.00 mL胍基乙酸标准储备溶液于100 mL容量瓶中, 用超纯水定容至刻度, 摇匀, 得到质量浓度分别为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 mg/L的胍基乙酸标准工作溶液。现用现配。
饲料样品提取:分别称取适量样品(2.0 g配合饲料、2.0 g浓缩饲料和0.50 g添加剂预混合饲料)于150 mL锥形瓶中, 加入60 mL超纯水, 超声提取20 min, 取上清液离心10 min, 经0.22 μm水相滤膜过滤, 待上机测定。高含量样品可适当稀释。离子色谱法可直接上机测定, 高效液相色谱法需柱前衍生。
茚三酮柱前衍生反应:移取0.8 mL胍基乙酸标准溶液或试样溶液于水解管中, 加入0.6 mL 1.3 mol/L氢氧化钾溶液、0.3 mL 9 g/L茚三酮溶液, 涡旋混合10 s, 室温反应15 min后依次加入为0.2 mL 50 g/L抗坏血酸溶液和0.2 mL 5 mol/L磷酸溶液, 涡旋混合10 s, 于90 ℃密封反应45 min, 冷却至室温, 过0.22 μm水相滤膜, 待高效液相色谱仪检测。
茚三酮柱前衍生法色谱柱:Symmetry C18分析柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm); 流动相:0.05%(体积分数)三氟乙酸水溶液-乙腈(82:18, v/v); 流速:1 mL/min; 柱温:30 ℃; 进样量:10 μL; 荧光检测器激发波长390 nm, 发射波长470 nm。
离子色谱法色谱柱:Dionex IonPacTM CS16阳离子交换柱(250 mm×5.0 mm); 流动相:A相为超纯水, B相为100 mmol/L甲磺酸水溶液; 流速:1.0 mL/min; 检测波长:200 nm; 柱温:35 ℃; 进样量:10 μL。梯度洗脱程序:0~2 min, 12%B; 2~14 min, 12%B~35%B; 14~16 min, 35%B~100%B; 16~23 min, 100%B; 23~24 min, 100%B~12%B。
本文旨在建立一种饲料中胍基乙酸的测定方法, 为得到最优的分离分析效果, 从色谱条件和样品前处理等方面进行了条件优化。
胍基乙酸结构简单、极性较高, 在普通反相分离模式色谱柱上保留时间较短, 且无特征荧光或紫外吸收, 直接测定灵敏度较低。针对这两个难点, 本文首先考察了柱前衍生-荧光检测法。有文献[9]报道胍基乙酸与茚三酮在碱性条件下可反应生成具有荧光信号的衍生产物, 对该衍生物进行检测可大大提高胍基乙酸分析的灵敏度, 衍生过程及色谱条件详见1.3和1.4节。将此衍生方法用于实际样品分析, 结果表明, 柱前衍生法对成分简单的高纯度胍基乙酸产品成分分析准确度较高; 但对复杂基质如添加剂预混合饲料、配合饲料等样品效果不理想, 基质中的营养成分如微量元素、维生素等都会干扰衍生反应, 衍生效率仅为5%~20%, 因此不适用于饲料样品中胍基乙酸的检测。最终选择离子色谱法继续优化饲料中胍基乙酸的检测条件。
色谱柱是离子色谱的核心, 寻找对分析目标有较强保留的色谱柱是建立新的离子色谱分析方法的重要环节。胍基乙酸结构上属于有机弱酸, 同时含有单氰胺结构, 既可带正电荷又可带负电荷, 化学性质很适合进行离子交换模式的探索。考察了多款阴阳离子交换柱对胍基乙酸的保留能力, 试验结果表明, 单氰胺结构上的正电荷使胍基乙酸在阳离子交换柱上有较强保留, 最终选择柱容量较大的Dionex IonPacTM CS16阳离子交换柱开展进一步的研究。
为考察流动相浓度对胍基乙酸保留性能的影响, 配制不同浓度(10、15、20和30 mmol/L)的甲磺酸溶液作为流动相。随着流动相中甲磺酸浓度的提高, 胍基乙酸保留时间逐渐缩短。综合考虑色谱峰的分离度及保留因子, 流动相浓度在15~20 mmol/L范围内较为合适。在进行实际样品检测时发现, 等度洗脱条件下饲料样品基质对胍基乙酸干扰严重, 且样品中添加的氨基酸、矿物元素等阳离子较难洗脱, 因而需进行梯度洗脱以提高分离度和柱子再生利用。最终采用的梯度洗脱条件见1.4节。
对胍基乙酸进行了190~400 nm紫外光谱扫描, 发现其仅在低波长范围有一定紫外吸收, 且随着波长的增大, 紫外吸收越来越弱, 波长大于210 nm之后紫外吸收趋近于无。综合考虑流动相及样品中的杂质背景干扰以及胍基乙酸的吸光度, 最终选择200 nm作为检测波长。另外, 发现柱温的升高会使胍基乙酸的保留时间变短、峰形更尖锐。综合考虑, 选择柱温为35 ℃。采用最优化色谱条件得到的色谱图见图 2。
为考察提取条件对胍基乙酸提取效率的影响, 选取不同pH范围的提取液(中性:超纯水; 酸性:0.1 mol/L盐酸溶液; 碱性:0.1 mol/L碳酸钠溶液)及振荡和超声两种提取方式对胍基乙酸进行提取。结果表明, 不同提取条件下胍基乙酸的回收率均能达到96%以上, 提取液对胍基乙酸的提取效果影响不大, 而超声方式相较于振荡提取效果更好。综合考虑, 选择用超纯水超声20 min进行提取。
胍基乙酸作为新型饲料添加剂在猪和肉鸡养殖中可使用的最低有效添加量为600 mg/kg, 最高限量为1 200 mg/kg[4-6], 由此估算后称取0.50 g预混合饲料、2.0 g浓缩饲料及2.0 g配合饲料, 加入60 mL提取液进行提取, 可满足胍基乙酸的溶解度要求。
饲料基质较为复杂, 不仅原料来源众多, 后续添加营养素种类更是繁多, 这其中对胍基乙酸分析影响最大的主要是胍基化合物, 如甲基胍、乙基胍、胍基丙酸、肌酸、肌酐等, 另外氨基酸添加剂中的精氨酸及其他精氨酸基寡肽等都对其测定有较大干扰[8]。由图 3可见, 在梯度洗脱条件下饲料样品中的基质干扰对胍基乙酸测定无明显影响。
配制质量浓度为0.5~200 mg/L的胍基乙酸标准工作溶液, 以峰面积为纵坐标(Y)、质量浓度为横坐标(X, mg/L)得到线性回归方程Y=9.886 2X-0.756 4, 线性相关系数r2为0.999 9。胍基乙酸标准溶液的检出限和定量限分别为170和500 μg/L。因衍生产物一般具有较好的荧光或紫外吸收信号, 应用较多的柱前衍生法[8-10]的定量限一般在20~40 μg/L之间。分别以3倍和10倍信噪比为检出限和定量限, 配合饲料、浓缩饲料中胍基乙酸的检出限和定量限分别为4.5和15 mg/kg, 添加剂预混合饲料中胍基乙酸的检出限和定量限分别为9.0和30 mg/kg。
为考察方法的准确度, 选取猪用添加剂预混饲料、浓缩饲料、配合饲料及鸡用配合饲料进行空白添加回收试验。胍基乙酸添加范围为15 mg/kg~60 g/kg, 测定结果见表 1, 4种饲料中胍基乙酸的回收率均大于94%, RSD均小于6%(n=5), 可满足实际样品测定的需求。
为考察方法的精密度, 选取胍基乙酸添加量为1 000 mg/kg的猪用添加剂预混饲料作为试样进行测定, 由同一人员连续测定3天, 每天重复测定3次。日内相对标准偏差(RSD)分别为4.90%、3.50%和1.69%, 日间RSD为2.08%。
为考察方法的重复性, 选取胍基乙酸添加量为1 000 mg/kg的肉鸡用添加剂预混饲料作为试样进行测定, 样品重复测定6次, 试样中胍基乙酸平均测定含量为960.25 mg/kg, 6次测定的RSD为3.88%, 重复性良好。
本文建立了紫外检测-离子色谱分析饲料中胍基乙酸的方法, 并对样品的前处理、色谱柱的选择、淋洗液的梯度等色谱进行了优化。在优化条件下, 胍基乙酸与饲料样品基质分离良好, 回收率好, 准确度较高。方法可满足饲料生产企业及监管部门对不同类型猪用、禽用饲料样品中胍基乙酸含量的日常监督检测。
2017,
Vol. 35 Issue (10): 1100-1104
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