咪唑类药物是一类具有咪唑环的化合物, 它的抗菌和抗原虫活性与其结构密切相关, 具有很强的细胞毒性。该类药物主要通过抑制细胞DNA的合成, 起到有效控制感染的作用, 是一种合成的抗真菌药, 因其效果显著、价格便宜, 受到了养殖户们的青睐。咪唑类药物主要有苯并咪唑类和硝基咪唑类药物, 由于部分咪唑类药物代谢迅速, 其代谢物在体内维持时间较长, 且保留了与原药类似的毒性[1], 因此需要引起高度重视。自20世纪90年代起, 欧盟[2]就已经逐步禁止洛哒硝唑、地美硝唑和甲硝唑用于食用动物。2002年美国食品与药物管理局[2]公布禁止在动物源性食品中使用11种药物, 其中包括地美硝唑和其他硝基咪唑类药物。近年来, 我国[2, 3]也对咪唑类药物的使用进行了严格的监控, 规定在食用动物源性食品中硝基咪唑类药物不得检出, 苯并咪唑类药物的限量值为50~1 000 μg/kg。然而, 国内一些养殖户为了追求更高的经济效益, 滥用该类药物, 导致了这些药物在动物体内残留[4], 由此引起的食品安全问题不容小觑。
目前, 测定咪唑类药物及代谢物残留的方法主要包括气相色谱法[3]、高效液相色谱法[5-7]、气相色谱-串联质谱法[8, 9]、液相色谱-串联质谱法[10-18]等。液相色谱法多采用紫外检测器检测, 灵敏度低, 而且易被杂质干扰, 不仅增加了前处理的难度, 而且耗时长; 气相色谱-串联质谱法灵敏度虽然较高, 但受化合物性质的限制, 检测的项目有限。液相色谱-串联质谱法以其高灵敏度、高通量、强抗干扰等特点, 近年来被广泛应用于咪唑类药物及其代谢物残留的检测[10-18]。而当前咪唑类药物检测的研究大多是针对其中的一种或者几种药物进行分析, 缺少一种高通量的检测方法, 难以满足现代分析技术快速、高效的要求。本方法通过对仪器和前处理方法的优化, 采用高效液相色谱-串联质谱法, 实现了猪肉中咪唑类药物及其代谢物共计29种目标物残留的检测。该方法具有高效、快速、检测成本低、灵敏度高的特点, 是一种高通量的筛查方法, 可为相关监管部门监控动物源性食品中的咪唑类药物提供较为全面的参考依据。
LCMS-8050液相色谱-串联质谱仪(日本岛津公司); Waters Cortecs C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, 美国Waters公司); Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司); 超声波提取仪(济宁天华超声电子仪器有限公司); AUTO EVA全自动平行浓缩仪(瑞科仪器有限公司); Avanti J-E高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司); 漩涡混匀器(江苏康健医疗用品有限公司)。
29种咪唑类药物及其代谢物标准品(见表 1)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷(色谱纯, 山东禹王实业有限公司化工分公司); 氨水(分析纯, 西陇科学股份有限公司); 甲酸(优级纯, 德国Merck公司); 实验用水为超纯水。
准确称取适量各标准品(25 mg)于25 mL容量瓶中, 用甲醇定容后制得1 g/L的单标准储备液(部分不易溶解的标准品如氧苯达唑、阿苯达唑等需先用适量甲酸溶解后再用甲醇定容), 于-40 ℃下避光保存。再分取一定量的各单标准储备液用甲醇逐级稀释配制成混合标准中间液, 于4 ℃下避光保存。
称取2.0 g样品于50 mL离心管中, 加入10 mL乙酸乙酯, 涡旋混合1 min, 超声提取30 min, 以4 500 r/min的速度离心3 min。移取5 mL上清液于10 mL刻度管中, 于45 ℃下用氮气缓慢吹干, 加入1 mL 10%(体积分数, 下同)乙腈水溶液(含0.2%甲酸)溶解残渣, 涡旋1 min。加入1 mL乙腈饱和正己烷涡旋1 min, 静置分层, 弃去正己烷层, 下层再用1 mL乙腈饱和正己烷净化一次, 静置至分层, 取下层过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜, 上机测试。
色谱柱:Waters Cortecs C18色谱柱; 柱温:40 ℃; 进样量:1.0 μL。流动相A为0.3%甲酸水溶液, 流动相B为乙腈; 流速:0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0~5.00 min, 10%B~60%B; 5.00~6.00 min, 60%B~90%B; 6.01~8.00 min, 10%B。
离子源:电喷雾离子源正离子(ESI+)模式; 加热气温度:400 ℃; 脱溶剂管温度:250 ℃; 干燥气流速:6 L/min; 雾化气流速:2.5 L/min; 加热气流速:10 L/min; 扫描模式:多反应监测(MRM)。29种化合物的质谱参数见表 1。
选择合适的流动相不但能够提高目标化合物的灵敏度, 而且可以改善目标物的峰形。本方法采用ESI+进行检测, 故在流动相里加入甲酸可以极大提高目标物的响应[18]。分别采用纯水、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲酸水溶液作为水相、乙腈作为有机相进行试验。结果发现, 当采用纯水作为水相时, 羟基甲硝唑和2-硝基咪唑等极性较强的化合物峰形极差; 随着甲酸体积分数的增加, 各化合物的响应也随着变大, 并且羟基甲硝唑和2-硝基咪唑等的峰形也得到改善, 呈现良好的对称性。当采用0.3%甲酸水和0.4%甲酸水作为水相时峰面积响应的增加趋于平缓。考虑到酸度太强会影响到色谱柱的寿命等因素, 故最终采用0.3%甲酸水溶液作为水相、乙腈作为有机相进行分析。29种咪唑类药物的总离子流色谱图见图 1。
采用正离子模式对29种化合物进行一级质谱全扫描, 得到每种化合物的母离子。采用产物离子扫描模式对母离子进行二级质谱碎片离子扫描, 得到碎片离子的信息, 选择两对特征子离子进行四极杆电压和碰撞能等质谱参数进行优化, 使两对特征离子对的响应达到最佳。
咪唑类药物常用的提取剂有甲醇、氯仿、乙腈和乙酸乙酯等[17, 18]。当采用氯仿作为提取剂时容易发生乳化现象, 回收率较低, 且氯仿毒性较大, 因此本试验选择甲醇、乙腈、乙酸乙酯作为提取剂进行比较, 具体结果见表 2。可以看出甲醇、乙腈和乙酸乙酯对大部分咪唑类药物的提取效率差别不大, 但是对极性较强的4-硝基咪唑和极性较弱的芬苯达唑和氟苯咪唑表现出不同的提取效率, 当采用乙酸乙酯提取4-硝基咪唑时回收率为62.3%, 而甲醇和乙腈提取时的回收率达到90%以上; 采用甲醇和乙腈提取芬苯达唑和氟苯咪唑时, 回收率均低于50%, 远不如乙酸乙酯提取的效率高。同时对比3种提取剂的基线噪声, 发现乙酸乙酯较甲醇和乙腈两者基线噪声平稳。此外, 由于乙酸乙酯的沸点较低, 氮吹时可以减少个别对热较为敏感的咪唑类药物的损失[17], 最终确定采用乙酸乙酯作为提取剂。
咪唑类药物残留的检测主要采用过固相萃取小柱的方式对样品进行净化[15-18], 本文比较了两种净化方式, 一种是采用正己烷进行液液萃取净化, 另一种是采用乙酸乙酯提取后转化溶剂用HLB小柱进行固相萃取净化。对比两者净化后的基线噪声都较为平稳, 但是后者需要加热转化溶剂再进行过柱净化, 导致整体回收率降低, 且前种净化方式相比于后者耗时更短, 成本更低, 回收率更高。所以本文采用正己烷进行净化除脂。
基质效应(ME)是指在分析样品时, 一些内源性共萃物有可能通过影响目标物的离子化, 从而造成目标物响应增强或者抑制的效应。以公式ME=(空白基质标样的响应值/纯溶剂标样的响应值-1)×100%来计算29种咪唑类药物的基质效应。当ME为正值时表示基质增强, 反之则为基质抑制, 绝对值越大表示基质效应越强, 具体结果见表 3。可以看出多种咪唑类药物的基质效应已经超过10%, 因此为了准确地定量, 本文采用不含目标物的空白猪肉样品提取液配制系列基质标准溶液来校正回收率, 以消除基质效应对结果的影响。
取29种咪唑类药物混合标准中间液, 以空白样品提取液稀释, 配制成质量浓度为0.05、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 μg/L的系列标准工作溶液, 进行测定。以峰面积为纵坐标(Y)、对应的质量浓度为横坐标(X, 单位为μg/L)绘制标准曲线。结果表明, 各组分在0.05~20.0 μg/L范围内线性关系良好, 相关系数(r2)均大于0.99。以特征定量离子对色谱峰的信噪比(S/N)=3为检出限(LOD), S/N=10为定量限(LOQ), 得到检出限为0.02~0.3 μg/kg, 定量限为0.1~1 μg/kg。具体结果见表 3。
采用猪肉阴性样品进行加标回收和精密度试验。向猪肉阴性样品中添加1.0、2.5、5.0 μg/kg 3个水平的混合标准中间液, 进行加标回收试验, 每个水平平行测试6个样本, 结果见表 3。在1.0~5.0 μg/kg添加范围内, 平均回收率为65.4%~103%, 相对标准偏差为1.3%~6.8%。
用本方法对20份市售猪肉样品进行了检测, 结果发现有1份样品中检出奥芬达唑砜(0.4 μg/kg)和氧苯达唑(1.0 μg/kg)(见图 2)。其余样品均未检出相关化合物。
本文建立了液相色谱-串联质谱检测猪肉中29种咪唑类药物及其代谢物残留的方法。采用乙酸乙酯作为提取剂提取化合物, 正己烷脱脂, 最后用液相色谱-串联质谱仪进行测定。本方法具有高效率、高通量、高灵敏度、低检测成本等特点, 可为相关监管部门进行咪唑类药物及其代谢物的残留检测提供快速筛查的参考依据。
2017,
Vol. 35 Issue (10): 1062-1067
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2017,
Vol. 35 Issue (10): 1062-1067
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