麦卢卡(manuka)蜂蜜是新西兰特有的一种珍贵蜜种, 是由新西兰特有的一种灌木麦卢卡(leptospermum scoparium)的花蜜酿造而成的。麦卢卡蜂蜜与其他蜂蜜的区别在于其具有强大而独特的抗菌活性[1]。蜂蜜一般都具有抗菌活性, 这是由蜂蜜本身的高渗透性、较强的酸度和含有过氧化物造成的, 而麦卢卡蜂蜜的抗菌活性则不依赖于过氧化物, 因此被称为非过氧化抗菌活性(non-peroxide antibacterial activity, NPA)[2]。麦卢卡蜂蜜优越的抗菌活性可用于治疗伤口感染[3], 帮助伤口愈合[4], 具有较高的药用价值[5]。近10年来新西兰麦卢卡蜂蜜的出口率每年增长约10%, 2013年, 新西兰出口的蜂蜜价值高达1.28亿新西兰元。但是根据新西兰一家蜂农协会的统计, 新西兰每年大约只出产1 700~2 000吨的麦卢卡蜂蜜, 而在全球范围内, 每年以麦卢卡名义出售的蜂蜜高达1万吨[6]。使用独特麦卢卡因子(unique manuka factor, UMF)标注麦卢卡蜂蜜的活性存在测量不稳定、误差较大的情况[7], 而麦卢卡蜂蜜中常非法添加人工合成的甲基乙二醛(methylglyoxal, MGO)或二羟基丙酮(DHA)以提高其活性, 从而谋取暴利, 导致以MGO为标准标注麦卢卡蜂蜜活性失去了可参考性[8, 9]。2016年, 新西兰麦卢卡协会(UMFHA)根据Kato等[10]发现的麦卢卡蜂蜜新特征标识物3, 5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷(leptosperin)推出了麦卢卡蜂蜜的新分级体系, 并在其协会网站上(http://www.umfhoney.org/)进行了公布。3, 5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷是丁香酸甲酯的糖苷类转化物, 热稳定性较好, 可长期储存[11]。此前已有学者运用高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)、高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-PDAD)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、酶联免疫分析法、免疫层析法和荧光光谱法等[12-16]对特征化合物进行了检测, 其中质谱法具有较高的灵敏度和选择性。
本文建立了全自动在线固相萃取-液相色谱-高分辨质谱(SPE-LC-HRMS)快速、准确测定麦卢卡蜂蜜中新特征标志物3, 5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷的方法, 并对95个取自新西兰蜂巢的成熟原蜜和其他4个国家50个商品化的蜂蜜进行了检测和验证。
SYMBIOSIS SPH1240液相色谱系统(美国AB SCIEX公司), 配有在线固相萃取装置, 08xx Oasis HLB固相萃取柱(美国Waters公司); Q Exactive高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司); ELGA-Q15高纯水发生器(英国ELGA公司)。
3, 5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷标准品(纯度＞99%)购自美国Alfa Aesar公司; 乙腈(色谱纯)购自德国Merck公司; 甲酸(色谱纯)购自美国Tedia公司; 0.45 μm尼龙微孔滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)。蜂巢成熟原蜜来源于新西兰各地区; 商品化蜂蜜购自各大超市。
准确称取10 mg 3, 5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷标准品于10 mL容量瓶中, 用乙腈定容, 配制成质量浓度为1.0 g/L的标准储备液, 于4 ℃冰箱中贮存。用乙腈-水(1:9, v/v)逐级稀释上述标准储备液, 配制质量浓度为0.5~100.0 mg/L的系列标准溶液。
准确称取1.0 g蜂蜜样品, 置于50 mL带盖聚四氟乙烯离心管中, 用水定容至10 mL, 涡旋振荡混匀, 取约1 mL上层清液, 过0.45 μm尼龙微孔滤膜, 待仪器分析。
采用1 000 μL甲醇以5 000 μL/min的流速对固相萃取柱进行活化，然后采用1 000 μL水以5 000 μL/min的流速对其进行平衡。采用500 μL水以250 μL/min的流速对样品进行上样后，采用500 μL水对固相萃取小柱进行淋洗, 流速为1 000 μL/min，然后采用300 μL甲醇在集中洗脱模式下以高压分流模块(high pressure for dispenser, HPD)进行洗脱, 流速为150 μL/min。
色谱柱:Dikma Diamonsil Plus C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm); 柱温:室温; 流动相:A为0.1%(v/v)甲酸水溶液, B为乙腈。梯度洗脱程序:0~0.75 min, 5%B; 0.75~2.00 min, 5%B~15%B; 2.00~4.00 min, 15%B~70%B; 4.00~6.00 min, 70%B~98%B; 6.00~6.50 min, 98%B; 6.50~7.00 min, 98%B~5%B; 7.00~10.00 min, 5%B。流速:0.8 mL/min; 进样体积:10 μL。
离子源:电喷雾离子(ESI)源, 负离子模式; 检测方式:二级扫描模式(Target-MS2); 毛细管加热温度:320 ℃; 鞘气(N2)流速:40 L/min; 辅助气(N2)流速:10 L/min; 吹扫气(N2)流速:3 L/min; 喷雾电压:3 kV; Target-MS2扫描分辨率(R): 17 500;最大驻留时间:100 ms; 分离窗口:m/z 2.0;自动增益控制(AGC): 2×105。特征标志物的其他质谱参数见表 1。
麦卢卡蜂蜜中含有麦卢卡因子UMF、甲基乙二醛等多种活性成份, 对麦卢卡蜂蜜直接稀释进样分析，发现存在基质增强效应, 回收率为120%~150%, 且更换色谱柱和调节梯度洗脱程序以降低基质增强效应的效果并不明显, 因此尝试使用固相萃取对样品进行净化。麦卢卡蜂蜜的特征标志物3, 5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷为含多羟基与苯甲酸酯类的糖苷, 整体极性较强, 因此选择含有亲脂性的二乙烯苯和亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮填料的Oasis HLB固相萃取柱对样品进行在线净化。实验发现, 由于样品在水中溶解性较好，在淋洗步骤中, 淋洗流速对特征标志物在固相萃取柱上的保留有较大影响, 因此考察了不同淋洗流速(900 ~1 500 μL/min)对麦卢卡蜂蜜中特征标志物回收率的影响(见图 1), 其中标志物的本底值为994 mg/kg。
从图 1中可以发现, 在淋洗体积为500 μL的条件下, 当淋洗流速为1 200 μL/min时, 样品特征物的回收率下降约10%;流速为1 500 μL/min时, 样品特征标志物的回收率仅为70%, 推断由于淋洗流速过快而出现穿透现象。综合考虑分析效率和回收率, 最终选择淋洗流速为1 000 μL/min。在本实验优化的在线固相萃取条件下, 麦卢卡蜂蜜的基质增强效应得到了较为有效的抑制, 回收率下降为90%~95%。
实验分析比较了水-乙腈、5 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈、0.1%(v/v)甲酸溶液-乙腈、含5 mmol/L乙酸铵的0.1%(v/v)甲酸溶液-乙腈作为流动相时目标化合物的分离情况。结果表明, 在ESI-模式下, 在流动相中加入一定含量的乙酸铵可使保留时间延长, 但目标化合物色谱峰的峰形会出现拖尾、不对称的现象; 在流动相的水相中加入少量的甲酸后, 目标化合物的保留时间会提前, 但峰形较好, 因此最终确定以0.1%(v/v)甲酸溶液-乙腈为流动相。
用流动注射分析(FIA)的方式将目标化合物的标准溶液直接注入质谱仪, 进行全扫描(m/z 100~1 000) 检测, 得到m/z为581.170 3的一级准分子离子峰[M-H]-, 通过对喷雾电压、碰撞能量、喷雾气流量等参数的优化, 选取信号强度最强的二级子离子碎片作为定性和定量离子, m/z分别为211.060 3和196.037 0, 目标化合物标准溶液(10 mg/L)的二级离子色谱图见图 2。
配制质量浓度为0.5~100.0 mg/L的标准溶液, 按优化后的方法进样, 以化合物的峰面积为纵坐标(y)、对应的含量为横坐标(x, mg/L)进行线性回归。结果表明, 线性方程为y=5.18×106x+1.67×103, 相关系数(R2)为0.999 3。说明3，5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷在0.5~100.0 mg/L范围内线性关系良好。方法的检出限(LOD, S/N≥3) 和定量限(LOQ, S/N≥10) 分别为3 mg/kg和10 mg/kg。
在3种不同品种的蜂蜜样品中添加低、中、高3个水平的3, 5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷标准品(其中麦卢卡、卡奴卡蜂蜜的添加水平为50.0、100.0和200.0 mg/kg, 洋槐蜜的添加水平为10.0、20.0、50.0 mg/kg), 每个水平做6份平行样品, 外标法定量, 进行加标回收率试验(见表 2)。结果表明, 3, 5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷的加标回收率为82.0%~95.2%, 精密度为2.7%~9.7%。其中加标洋槐蜜样品(10.0 mg/kg)的色谱图见图 3。
新西兰麦卢卡协会规定蜂蜜中3, 5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷含量≥100 mg/kg的为麦卢卡蜂蜜, 否则为非麦卢卡蜂蜜。通过对来自新西兰不同产地的麦卢卡、卡奴卡、瑞瓦瑞瓦、圣诞花、甘露蜜、塔瓦瑞、三叶草、瑞塔、卡玛希、琉璃苣、塔库和未知花型12个不同品种共计95个取自蜂巢的成熟原蜜样品以及来自新西兰、中国、澳大利亚和马来西亚4个国家的50个商品化蜂蜜(包括39个新西兰的百花蜜、麦卢卡蜜、野花蜜、忍冬蜜、圣诞花蜜、儿童蜂蜜样本; 4个中国的枣花蜜、益母草蜜、党参蜜和黄芪蜜样本; 6个澳大利亚的红柳桉蜜、石楠蜜、桉树蜜和野桉熟蜜样本; 1个马来西亚的相思树蜜样本)进行了检测(见表 3)。结果发现, 39个标明单花种麦卢卡蜂蜜的蜂巢成熟原蜜样本中有31个样本(79.5%)中的特征标志物含量超过了100 mg/kg, 具体为112~329 mg/kg, 8个样本(20.5%)的含量为50~95 mg/kg; 8个标明多花种麦卢卡蜂巢成熟原蜜中有3个样本(37.5%)特征标志物含量超过100 mg/kg, 其余5个样本(62.5%)的特征标志物含量为25~96 mg/kg; 48个非麦卢卡蜂巢成熟原蜜中有1个圣诞花和1个未知花型的蜂蜜共计2个样本(4.2%)标志物的含量中超过了100 mg/kg, 其余46个样本(95.8%)低于100 mg/kg。20个来自新西兰商品化单花种的麦卢卡蜂蜜样品中, 有15个样本(75.0%)的特征标志物含量为136~311 mg/kg, 5个样本(25.0%)低于100 mg/kg, 为12~96 mg/kg; 2个商品化新西兰多花种麦卢卡蜜样本中有1个(50.0%)低于100 mg/kg; 非麦卢卡蜂蜜样品的含量为0~59 mg/kg, 28个样品(100.0%)均低于100 mg/kg。
研究结果表明, 按照UMFHA协会规定麦卢卡和非麦卢卡蜂蜜的判断标准, 25%的商品化纯麦卢卡蜂蜜会被判为非麦卢卡蜂蜜。在标明新西兰单花种、多花种麦卢卡蜂巢原蜜中发现部分样品中特征标志物的含量低于100 mg/kg的限量规定, 而非麦卢卡蜂巢原蜜中发现少部分样本特征标志物的含量超过100 mg/kg, 推断可能是由于蜜蜂采集花蜜的蜜源地会存在其他蜜源植物, 而蜜蜂采集花蜜是随机的。
本文建立了全自动在线固相萃取-液相色谱-高分辨质谱检测蜂蜜样品中特征标志物3, 5-二甲氧基苯甲酸甲酯-4-双葡萄糖糖苷的分析方法。该法快速、简便, 为解决进口新西兰麦卢卡蜂蜜的判别提供了技术支持。
2017,
Vol. 35 Issue (10): 1068-1072
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2017,
Vol. 35 Issue (10): 1068-1072
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