盐酸特拉唑嗪(terazosin hydrochloride)是一种新型的选择性α₁-肾上腺能受体拮抗剂,临床主要用于轻、中度高血压的治疗,并对原发性高血压患者左心室肥大有一定疗效,还对良性前列腺增生具有明显改善作用,其主要通过阻断膀胱和血管壁平滑肌的肾上腺素而发挥疗效^{[1, 2]}。

稳定性研究对药物研发过程中化合物优化及药物的长期储存具有重要的指导意义,药物的降解可能导致活性降低或诱发新的副作用。ICH(International Conference on Harmonization)稳定性检测指导原则Q1A(R2)指出应对药物降解产物的鉴定、降解途径及稳定性进行研究^[3]。近年来,高效液相色谱-高分辨多级质谱(HPLC-HRMSn)联用技术在药物降解产物结构鉴定方面得到了广泛的应用^{[4, 5, 6]}。文献^{[7, 8, 9]}报道了盐酸特拉唑嗪的含量测定和有关物质的检测方法,其重点均在于优化色谱条件以保证原形药物与有关物质实现有效的色谱分离,而有关其稳定性及降解产物结构鉴定的研究未见报道。本文采用HPLC-HRMSn法对盐酸特拉唑嗪原料药在破坏性条件下的降解产物进行结构鉴定,为盐酸特拉唑嗪的进一步开发及长期保存条件筛选提供可靠的科学依据。

盐酸特拉唑嗪原料药(纯度＞98.5%,大连美仑生物技术有限公司);甲醇(德国Merck公司)、乙酸和乙酸铵(北京迪马科有限公司)均为色谱纯;氢氧化钠(天津市天大化学试剂厂)、浓盐酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)和质量分数为30%的H₂O₂(天津市博迪化工有限公司)均为分析纯;实验用水为超纯水。

LTQ Orbitrap XL液相色谱-高分辨质谱联用仪配有电喷雾离子化(ESI)源、Accela 1250四元梯度泵、Accela AS自动进样系统、Accela光电二极管阵列(PDA)检测器和Thermo Xcalibur 2.1数据处理系统(美国Thermo Fisher公司);KQ-200DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。

采用Hypersil Gold C18柱(150 mm×2.1 mm,5 μm);流动相A：甲醇;流动相B：含体积分数为0.5%冰醋酸的5 mmol/L醋酸铵水溶液。梯度洗脱程序:0～7 min,A相由20%上升至35%,并维持该比例至20 min停止;流速为200 μL/min。检测波长为240 nm。采用ESI源,源喷射电压为4.0 kV,鞘气流速为5.0 L/min,辅助气流速为3.3 L/min,加热毛细管温度为275 ℃。正离子模式检测,扫描方式为一级、二级及三级全扫描,分辨率为30 000。

参照ICH指导原则Q1A(R2)^[3]确定盐酸特拉唑嗪原料药破坏性试验条件。试验中所使用的药物质量浓度为1.0 g/L,分别在酸性(2 mol/L HCl)、碱性(2 mol/L NaOH)和中性(纯水)条件下进行了水解降解试验(于80 ℃反应4 h)。在质量分数为30%的H₂O₂水溶液中进行强氧化破坏性降解试验(80 ℃,4 h)。降解试验后分别加入碱溶液或酸溶液调pH至中性,加水稀释至终浓度为0.5 g/L,经0.2 μm微孔滤膜过滤,取5 μL进样,进行HPLC-HRMSⁿ分析。

本文采用破坏性条件考察了盐酸特拉唑嗪在强酸、强碱、中性及强氧化性条件下的稳定性,图 1为其产物的色谱图。盐酸特拉唑嗪在中性水溶液中稳定性较好,在碱性条件下几乎完全降解(99.1%),在酸性条件下有少量降解(3.3%),且酸性和碱性条件下降解产物较单一,极性较大,推测可能为酰胺键水解的产物。在强氧化条件下盐酸特拉唑嗪同样发生了部分降解(3.4%),除产生了与酸性和碱性条件下共同的降解产物外,其他降解产物种类明显增多,故本文主要针对强氧化条件下盐酸特拉唑嗪的降解产物进行详细研究。

图1

Fig.1

图1 破坏性条件下盐酸特拉唑嗪降解产物的典型色谱图 Fig.1 Typical chromatograms of the degradation products of terazosin hydrochloride under the stressed conditions

为确定降解产物的结构,对盐酸特拉唑嗪进行了一级及多级全扫描质谱分析,确定其合适的能量,根据主要裂解碎片总结其质谱裂解规律,为进一步确定特拉唑嗪降解产物的结构提供可靠的依据。

推测特拉唑嗪的质谱裂解规律如图 2所示。特拉唑嗪在一级全扫描质谱中生成的准分子离子[M+H]⁺为m/z 388.197 2,对准分子离子m/z 388.197 2进行二级全扫描质谱分析,产生的主要碎片离子为m/z 290.161 2和247.118 4;进一步对二级碎片离子m/z 290.161 2和247.118 4进行三级质谱分析,产生的主要碎片离子分别为m/z 247.118 4、232.095 1、231.087 4和221.103 0。推测其中m/z 290.161 2为酰胺键断裂脱去2-甲酰基四氢呋喃部分形成的碎片离子[M+H-C₅H₆O₂]⁺;m/z 247.118 4为碎片离子m/z 290.161 2进一步失去1分子乙烯胺形成的碎片离子[M+H-C₅H₆O₂-C₂H₅N]⁺。由此可知,盐酸特拉唑嗪的主要裂解碎片是由酰胺键和C-N键断裂而形成的^[6]。

图2

Fig.2

图2 ESI源下特拉唑嗪的主要质谱裂解途径 Fig.2 Proposed main fragmentation pathways of terazosin by ESI-MS

采用HPLC-HRMS/MS法对强氧化破坏性试验条件下的盐酸特拉唑嗪样品进行了详细研究,如图 3所示,除原形药物外共检测到15种降解产物(D1～D15),其中7种(D1～D6和D8)与文献^[7]报道的盐酸特拉唑嗪的有关物质相同,8种(D7和D9～D15)为新检测到的降解产物,相关的详细数据如表 1所示。本文主要针对新检测到的8种降解产物进行详细的结构解析和鉴定。

图3

Fig.3

图3 强氧化破坏性条件下盐酸特拉唑嗪降解产物的典型选择离子监测色谱图 Fig.3 Typical SIM chromatograms of the degradation products of terazosin hydrochloride generated under the stressed oxidation condition

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 盐酸特拉唑嗪氧化降解产物的推测结构及相关数据 Table 1 Proposed structures and the related analysis data of the oxidative degradation products of terazosin hydrochloride Degradation product tR/min [M+H]+ Proposed ion formula Delt/ ppm Product ions (m/z) Proposed chemical structure Terazosin 10.70 388 C19H26N5O4+ 1.96 290, 247, 221 D1 3.33 290 C14H20N5O2+ 0.003 247, 231, 221 D2 8.31 318 C15H20N5O3+ 0.024 290, 247, 231, 221 D3 17.3 493 C24H29N8O4+ -0.068 273, 247, 231 D4 D5 D6 8.88 9.13 10.07 386 C19H24N5O4+ -2.235 368, 358, 288, 247, 221 D7 10.13 390 C19H28N5O4+ -0.991 372, 290, 247, 221 D8 9.19 404 C19H26N5O5+ -1.295 386, 318, 290, 273, 247, 221 D9 7.13 404 C19H26N5O5+ -0.765 386, 368, 263, 245, 221 D10 9.82 404 C19H26N5O5+ -0.265 386, 306, 263, 247, 233 D11 10.18 404 C19H26N5O5+ -0.915 386, 306, 263, 237 D12 11.14 404 C19H26N5O5+ -3.516 386, 306, 263, 235 D13 11.71 376 C17H22N5O5+ -0.345 358, 278, 235 D14 5.25 320 C14H18N4O5+ -0.741 302, 284, 274, 263, 245 D15 5.75 320 C14H18N4O5+ -0.741 302, 284, 275, 247 tR: retention time.

表1 盐酸特拉唑嗪氧化降解产物的推测结构及相关数据 Table 1 Proposed structures and the related analysis data of the oxidative degradation products of terazosin hydrochloride

降解产物D7: ESI-MS测得降解产物D7[M+H]⁺离子的精确质量数为390.213 3,与离子式C₁₉H₂₈N₅O₄⁺相对应,保留时间为10.13 min,比特拉唑嗪[M+H]⁺离子质量数多2,元素组成上相应多2个氢原子。其在二级全扫描质谱分析中产生的主要碎片离子有m/z 372.201 9、290.160 3、247.118 6和221.102 7。其中碎片离子m/z290.160 3、247.118 6和221.102 7与原形药物相应的碎片离子完全相同,表明结构中酰胺键左侧的喹唑啉环和哌嗪环均未发生变化。碎片离子m/z 372.201 9是脱水峰,表明结构中含有羟基。故推测降解产物D7为特拉唑嗪结构中四氢呋喃环发生开环氧化的产物,即1-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)-4-(5-羟基戊酰基)哌嗪。

降解产物D8～12: ESI-MS检测到多个降解产物的准分子离子[M+H]⁺的精确质量数均为404.192 0,以m/z 404.192 0为目标离子进行精确质量筛选,允许最大偏差为5 ppm,获得提取离子色谱图(EIC),共检测到5个化合物,保留时间分别为9.19、7.13、9.82、10.18和11.14 min,与离子式C₁₉H₂₆N₅O₅⁺相应,比特拉唑嗪[M+H]⁺离子质量数多16,元素组成相应多1个氧原子,由此推测该5种降解产物均为特拉唑嗪的羟基化产物。其中D8与文献^[7]报道的有关物质6的质谱行为完全相同,故推测降解产物D8为特拉唑嗪呋喃环羟基化产物,即1-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)-4-(5-羟基-四氢呋喃-2-基甲酰基)哌嗪。

降解产物D9:保留时间为7.13 min,其在二级全扫描质谱分析中产生的主要碎片离子有m/z 386.181 7、368.171 3、263.113 5、245.103 0和221.102 6特征碎片(见图 4),与盐酸特拉唑嗪的主要二级碎片离子对比,未发现m/z 290.160 3和247.118 6特征碎片离子,表明羟基化发生在降解产物D1的结构单元。特征碎片离子m/z 386.181 7为[M+H-H₂O]⁺,且相对丰度较大,表明羟基位于易发生脱水反应的位置;另外,m/z 263.113 5比m/z 247.118 6多16,且m/z 221.102 6表明喹唑啉环未发生变化,由此说明羟基位于哌嗪环上。其反相色谱保留相对较弱,表明该化合物极性相对较大,不易形成分子内氢键,由此推测羟基化发生在哌嗪环的2位,即降解产物D9为1-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)-2-羟基-4-(四氢呋喃-2-基甲酰基)哌嗪。

图4

Fig.4

图4 降解产物D9的二级全扫描质谱图 Fig.4 Full product scan spectrum of the degradation product D9

降解产物D10:保留时间为9.82 min,其在二级全扫描质谱分析中产生的主要碎片离子有m/z 386.181 6、306.155 3、263.113 2、247.118 5和233.102 9。其中m/z 306.155 3和263.113 2分别比原形药物的特征碎片离子m/z 290.160 3和247.118 6多16,表明羟基化发生在降解产物D1的结构单元,m/z 247.118 6表明羟基化发生在哌嗪环上,由精确质量数推算m/z 233.102 9是m/z 263.113 2脱去一分子甲醛生成的(偏差为-2.16 ppm)。其裂解途径如图 5所示,推定羟基化应发生在哌嗪环的3位,即降解产物D10为1-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)-3-羟基-4-(四氢呋喃-2-基甲酰基)哌嗪。

图5

Fig.5

图5 降解产物D10的裂解途径 Fig.5 Proposed fragmentation pathway of the degradation product D10

降解产物D11和D12:保留时间分别为10.18和11.14 min,二者的质谱行为基本相同,二级质谱分析中产生的主要碎片离子有m/z 386.181 6、306.155 2、263.113 2和237.097 7(235.082 2)。其中m/z 306.155 2、263.113 2和237.097 7均比原形药物相应的碎片离子m/z 290.160 3、247.118 6、221.102 7多了16,表明羟基化发生在喹唑啉环上,若喹唑啉环的5位羟基化,则由于羟基与氨基形成分子内氢键而使极性相对较弱,相反若喹唑啉环8位发生羟基化则极性增强,由此推测降解产物D11为特拉唑嗪喹唑啉环上8位羟基化产物,即1-(4-氨基-6,7-二甲氧基-8-羟基-喹唑啉-2-基)-4-(四氢呋喃-2-基甲酰基)哌嗪;降解产物D12为特拉唑嗪喹唑啉环上5位羟基化产物,即1-(4-氨基-5-羟基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)-4-(四氢呋喃-2-基甲酰基)哌嗪。

降解产物D13: ESI-MS测得降解产物D13的准分子离子[M+H]⁺的精确质量数为376.161 2,与离子式C₁₇H₂₂N₅O₅⁺相对应,保留时间为11.71 min,比特拉唑嗪[M+H]⁺离子质量数少12,元素组成相应多1个氧原子,少2个CH₂单元,推测其可能是特拉唑嗪单羟基化和双去甲基化的产物。在二级全扫描质谱分析中产生的主要碎片离子有m/z 358.150 4、278.124 3和235.082 2,如图 6所示,碎片离子m/z278.124 3和235.082 2分别比原形药物相应的特征碎片离子m/z 290.160 3、247.118 6减少12,表明结构中降解产物D1结构单元发生了双去甲基和羟基化。另外脱水峰m/z 358.150 4相对丰度较弱(4%),与降解产物D11相似,由此推测降解产物D13为特拉唑嗪双O-去甲基化喹唑啉环8位羟基化产物,即1-(4-氨基-6,7,8-三羟基喹唑啉-2-基)-4-(四氢呋喃-2-基甲酰基)哌嗪。

图6

Fig.6

图6 降解产物D13的二级全扫描质谱图 Fig.6 Full product scan spectrum of the degradation product D9

降解产物D14和D15: ESI-MS测得降解产物D14和D15的准分子离子[M+H]⁺的精确质量数均为320.134 6,与离子式C₁₄H₁₈N₄O₅⁺相对应,保留时间分别为5.25 min和5.75 min,比降解产物D1[M+H]⁺离子质量数增加30,元素组成上相应多2个氧原子,少2个氢原子,推测为降解产物D1进一步羟基化和羰基化的产物。

降解产物D14在二级质谱分析中产生的主要碎片离子有m/z 302.124 0、284.113 5、274.129 2、263.113 2和245.102 8。其中m/z 302.124 0、284.113 5分别为[M+H-H₂O]⁺和[M+H-2H₂O]⁺,脱水峰明显说明结构中哌嗪环部分发生了羟基化;m/z 274.129 2为m/z 302.124 0脱掉1分子CO(偏差为-0.12 ppm)形成的;m/z 263.113 2与原形药物特征碎片离子m/z 247.118 6相比增加了16,说明哌嗪环部分发生了单侧羟基化,即羟基化和羰基化发生在异侧,可能的裂解途径如图 7所示。推定降解产物D14为特拉唑嗪酰胺键水解后哌嗪环发生异侧羟基化和羰基化的产物,即1-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)-3-羰基-5-羟基哌嗪。

图7

Fig.7

图7 降解产物D14的裂解途径 Fig.7 Proposed fragmentation pathways of the degradation product D14

降解产物D15在二级质谱分析中产生的主要碎片离子有m/z 302.124 0、284.113 5、275.113 4、和247.118 5。推测其裂解途径如图 8所示,m/z 302.124 0和284.113 5与D14相同,分别为[M+H-H₂O]⁺和[M+H-2H₂O]⁺峰,m/z 275.113 4是m/z 302.124 0脱HCN(偏差为-3.67 ppm)形成的,碎片离子m/z 247.118 5是m/z 275.113 4脱CO形成的,与原形药物相应的碎片离子相同,说明该化合物结构中哌嗪环的一侧未发生变化,由此推测降解产物D15为特拉唑嗪酰胺键水解后哌嗪环单侧同时发生羟基化和羰基化的产物,即1-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)-2-羰基-3-羟基哌嗪。

图8

Fig.8

图8 降解产物D15的裂解途径 Fig.8 Proposed fragmentation pathways of the degradation product D15

本研究利用LTQ Orbirap XL液相色谱-高分辨多级质谱在质谱分析过程中对一级和多级质谱分析的高分辨检测能力,采用了全扫描、产物离子扫描等多种检测和分析手段对盐酸特拉唑嗪在强氧化条件下产生的多种降解产物的结构进行了详细解析,并与色谱行为相结合对降解产物进行了结构推定和确证。稳定性考察结果及降解产物的结构确证将为盐酸特拉唑嗪的生产质量控制、长期储存条件的筛选及该药物的进一步开发提供可靠的科学依据。