维生素A,亦称为视黄醇(以下简称VA),是人体最重要的脂溶性维生素之一,必须由膳食提供,缺乏或过量均会对人体健康产生影响^[1]。

人体的VA约0～90%存储于肝脏中。在营养充分的个体中,血循环中的VA受到机体自我平衡机制的严格调控。VA营养水平的评估有多种方法,如膳食摄入评估、生理指标(暗适应)、临床症状(毕脱斑、角膜损伤)、生化指标(血清VA浓度、肝脏VA浓度)等。但上述方法在实际应用中均有一定的难度或不足。膳食摄入评估涉及评估类型及食物的定量;暗适应适用于VA明显缺乏的个体;而临床指标有可能是其他原因引起的,缺乏特异性;血清浓度则受到机体自我平衡机制的调控,并且机体在感染状态下,血清VA浓度会受到抑制。肝脏储备量最能客观反映机体VA营养状态,但仅能从尸检标本中获得,活体数据非常少见。

早在1989年,Furr等^[2]就利用稳定同位素稀释技术对人体肝脏VA储备量进行了研究,并提出估计肝脏VA储备量的Furr-Olson公式^[2]。目前该方法已在国际上广泛应用,并且成为推荐方法^{[3, 4, 5, 6, 7, 8]},以弥补之前评价方法的不足。但限于实验时间成本、检测技术挑战及检测成本,国内应用尚少。但同位素稀释技术在监测人群维生素A缺乏、公共卫生干预措施有效性以及复合补充剂补充、营养强化过量风险中显得尤为重要。我国作为发展中国家,上述问题共同存在。因此,发展同位素稀释技术，灵敏地反映体内维生素A的变化状态十分必要。

本实验在借鉴国际方法的基础上,利用稳定同位素稀释、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱/负化学电离源/四极杆质谱(GC/NCI/MS)检测技术估测人体肝脏VA储备量。实验详细优化了各步骤参数,提高了方法的灵敏度、稳定性等关键指标,并成功应用于实际样品检测中。

上述方法的成功构建不仅可以灵敏地反映人体肝脏VA营养状态变化,而且将此技术与VA干预实验相结合,当某一人群在摄入不同膳食VA水平一段时间后,可以推测该人群维持体内VA储备水平稳定的膳食摄入水平。用这种模式评价VA的需要量,突破了原来以预防VA明显缺乏为出发点的最低量推测,发展为维持体内正常VA生理储备状态的原位测定。不仅如此,稳定性同位素示踪技术的利用还进一步促进了经口摄入的VA源在体内生物转化效率方面的机理研究^{[9, 10, 11, 12]}。

高效液相色谱仪(1260 Infinity,美国Agilent公司),配G1322A型标准真空脱气泵、G1311B型四元泵、G1328B型标准自动进样器、G1316A型标准柱温箱、G4212B型DAD检测器以及ChemStation化学工作站;气相色谱/质谱仪(DSQ,美国Thermo公司),配AS3000自动进样器。恒温振荡器(HZQ-F150A,上海一恒仪器有限公司),氮吹仪(MD200-2,杭州奥盛仪器有限公司)。

正己烷(色谱纯,德国CNW公司);衍生化试剂(N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS),99：1(v/v),Supelco公司);乙醇(色谱纯,美国Tedia公司);氢氧化钾(分析纯,南京化学试剂有限公司); VA标准品(纯度＞ 95%,Sigma公司);氘化VA为²H₈-醋酸视黄醇(²H₈-retinyl acetate,²H₈-RAC)(美国TUFTS大学提供),为Cambridge Isotope Laboratory(Andover,MA)产品,纯度＞98%。

96名成年健康志愿者第1天早7时空腹开始实验(从前一天晚8时禁食但不限饮水)。7时给予无VA、无β-胡萝卜素的液体配方早餐(总能量2 093 kJ,脂肪热能比25%,蛋白质热能比14%)。早餐间口服一粒胶囊(1 mg ²H₈-RAC溶于170 mg玉米油)。第1天中餐和晚餐均给予低VA、低β-胡萝卜素膳食(全天VA摄入量＜200 μg视黄醇当量)。口服²H₈-RAC后21天(第22天晨7时),当体内VA储备池约达到代谢平衡状态时^[5],采集受试者空腹静脉血10 mL,收集血清后于-70 ℃冻存待测。该阶段其他时间里,受试者按照膳食原则和要求,参照建议食谱进餐。志愿者进入实验前均签署知情同意书。

血清复融混匀,取300 μL至离心管中,加入2 mL乙醇及1 mL氢氧化钾溶液(500 g/L),漩涡混匀后置于摇床中60 ℃下皂化90 min(转速150 r/min)。皂化完全后加入1 mL正己烷,充分涡旋,3 000 r/min下离心10 min后收集上层清液。下层液体中再加入1 mL正己烷,重复上述操作两次,将3次收集的上层提取液合并、氮吹,近干时加入70 μL乙醇复溶,并转移至带有玻璃内衬管的棕色样品瓶中待高效液相色谱分离、收集。整个过程均在实验室红灯下操作。高效液相色谱收集时间范围为3.1～5.1 min(VA组分),收集的组分经氮气吹干后加入70 μL衍生化试剂,70 ℃下衍生30 min,冷却后转移至带玻璃内衬管的棕色样品瓶中,制备好的样品置于干燥器中待气相色谱/质谱检测。整个过程避光、避水。

进样量50 μL,柱温30 ℃,Agilent C₁₈液相色谱柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm),流动相为甲醇-水(95：5,v/v),流速1 mL/min,检测波长324 nm。

色谱条件:Agilent DB-5毛细管柱(15 m×0.25 mm×0.25 μm),初始温度50 ℃,然后以15 ℃/min升至285 ℃,保持2 min;进样口温度为250 ℃;不分流进样,不分流时间1 min,进样量2 μL;载气(氦气)为恒流模式,流速1 mL/min;辅助气(甲烷)流速1.2 mL/min。

质谱条件:传输线温度280 ℃;化学电离(CI)源,负离子模式,温度200 ℃;电子轰击能量70 eV;发射电流100 μA;预四极杆电压-7.8 V;全扫描模式,扫描范围m/z 250～300,时间延迟2 min。

VA标准溶液:精密称取一定量VA标准品置于10 mL棕色容量瓶中,加乙醇定容至刻度,作为储备液;再用无水乙醇稀释,得到约10 μg/mL的应用液。整个过程在实验室红灯下操作。

²H₈-RAC标准溶液:精密称取一定量²H₈-RAC标准品置于10 mL棕色容量瓶中,加乙醇定容至刻度,作为储备液;再用无水乙醇稀释,得到约10 μg/mL的应用液。整个过程在实验室红灯下操作。

气相色谱/质谱数据由赛默飞Xcalibur系列软件处理。m/z 276的峰面积除以m/z 268的峰面积即为标记与未标记VA的丰度比。

根据Furr-Olson公式,肝脏总视黄醇储备量(TLR)=F×dose×｛S×a×[(1/D：H)-1]｝。其中,F为口服氘化VA肝脏存储效率(取0.5); dose为氘化VA补充剂量(取1 mg); S为血清与肝脏中活性VA的比值(取0.65); a为血样采集时仍存储在肝脏中的氘化视黄醇(a=e^-kt,k=1/140 d,t为血样采集时距口服氘化视黄醇的天数，本实验中为21 d); D：H为²H₈-VA与未标记VA的丰度比。

本研究采用²H标记的视黄醇为示踪物研究肝脏VA储备量,该方法对受试者没有危害和风险,已成为研究VA人体营养状态的推荐方法^{[6, 7, 8]}。在本研究中,受试者口服1 mg ²H₈-RAC,所摄入²H₈的量只有47.6 μg,对于体重60～70 kg的成人,只相当于体内增加0.000 7 mg/kg的²H₈。这种剂量水平的²H₈标记视黄醇,在国际上开展的相关研究中已经多次应用^{[7, 10]}。

血清通过皂化、正己烷粗提、氮吹近干后,用乙醇定容至一定体积,然后经高效液相色谱C₁₈柱分离，获得相对纯化的VA。VA正己烷提取回收率稳定在90%以上。因实验开展所补充的²H₈-RAC仅为1 mg,血清中的²H₈ -VA浓度不会太高,而生物样本取样量有限,血清体积较小,所以为使血清样品中的VA尽可能全部纯化回收,对高效液相色谱分离时的峰接收时间、进样量进行了专门的优化。

VA标准物质经自动进样器吸入,经C₁₈色谱柱分离后出峰时间(RT)为4.12 min(见图 1a)。紫外检测器流通池后连接PEEK(polyetheretherketone)管(长约25 cm,内径0.025 cm)。当峰接收时间为3.6～4.6 min时,VA的收集率为34.3%;当峰接收时间为3.1～5.1 min时,VA的收集率为98.5%。因此,实验选择一次性连续收集3.1～5.1 min共2 min的VA组分。

图1

Fig. 1

图1 (a) VA标准溶液和(b)血清样品中VA的色谱图 Fig.1 Chromatograms of VA in (a) standard solution and (b) serum sample

一定量的血清样本条件下,VA提取后最终定容体积越小,浓缩倍数越高,色谱检测峰响应越强,收集到的VA也越多。但实际操作时,过小的定容体积一般不易实现,而加大仪器进样量可在一定程度上弥补这一限制。高效液相色谱检测的进样体积一般为20 μL,本实验所用高效液相色谱仪最大进样量为100 μL,因此实验考察了20～100 μL不同进样体积的检测效果。结果显示,随着进样量的增加,VA色谱峰面积呈线性增加,但色谱峰形在进样量提升至80 μL时开始出现分叉的现象,因此将进样量设置为50 μL,同时样品用乙醇定容至70 μL。

考虑到视黄醇的化学性质及分子结构,采用三氟乙酰胺与视黄醇反应,衍生化后利用GC/MS进行测定。相比常用的电子轰击(EI)源,CI源为软电离源,具有谱图简单、灵敏度高等特点,且实验室对CI源的使用已较为成熟^[13],所以在测定视黄醇衍生物时选择CI源。对检测过程中影响灵敏度、稳定性的参数,如进样口温度、辅助气(甲烷)流量等进行了详细优化。

纯化收集好的VA,经氮气吹干后加入70 μL衍生化试剂,70 ℃下振摇反应30 min。衍生化的VA经GC/NCI/MS检测的色谱图见图 2(对比试剂空白):目标产物RT为12.36 min。VA及²H₈-VA的质谱图见图 3,VA基峰离子m/z 268,²H₈ -VA基峰离子m/z 276,二者的丰度比即为D：H。

图2

Fig. 2

图2 (a)试剂空白及(b)VA衍生物的色谱图 Fig.2 Chromatograms of (a) blank and (b) derivative of VA

实验考察了进样口温度分别为200、220、250、270和280 ℃时VA衍生物峰面积响应的变化,发现在250 ℃时,峰面积响应达到最大,因此将进样口温度设为250 ℃。

实验考察了不同甲烷气流速(1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 mL/min)对VA衍生物响应的影响,发现在1.2 mL/min流速下峰面积响应达到最大,因此将甲烷气流速保持在1.2 mL/min。

虽然实验最终需要的结果为标记和未标记维生素A的丰度比,不是绝对含量,但回收率影响整个方法的检出限。考察了血清中VA的提取效率、VA经HPLC分离纯化后的接收效率和VA在GC/MS检测前的衍生化效率。血清中VA的提取采用常规法(皂化后正己烷提取),回收率大于95%; VA经HPLC分离收集效率大于98%，即VA在衍生化进入GC/MS检测前的回收率大于90%(95%×98%)。VA衍生化后,在终浓度为26.4 μg/L时,信噪比(S/N)为10,基本满足样本检测要求。衍生化后的标准曲线方程为y=33.92x+790.7,其中y为峰面积，x为VA的质量浓度(ng/mL)。相关系数(r)大于0.99。

将混合血清基质分成若干份,每份300 μL,加入10 μg/mLVA标准品15 μL(相当于正常血清的浓度)(本底不加入标准物质),用于考察整个实验的回收率及日内、日间精密度(n=6)。根据衍生化标准曲线方程计算加标回收率,结果显示平均回收率大于85%,相对标准偏差均小于10%。

图3

Fig. 3

图3 (a)VA衍生物和(b)氘化VA衍生物的质谱图 Fig.3 Mass spectra of derivatives of (a) VA and (b)2H8-VA

在仪器条件优化的基础上,以S/N=10确定仪器的定量限为26.4 μg/L。若取样品血清300 μL,最终定容体积为70 μL,则血清中视黄醇浓度达到6 μg/L时即可检出。实验中口服²H₈-VA为1 mg,对于体重65 kg的成年人,在VA营养水平正常的情况下,按照90%的²H₈-VA存储于肝脏估计(其他因素暂忽略),约0.1 mg的²H₈-VA进入血液。人体血清量约为体重的0.043 5,65 kg的成年人血清约2 800 mL,则²H₈-VA在血清中的质量浓度约为35.7 μg/L,为可检质量浓度(6 μg/L)的5～6倍。对于VA营养不足的个体,²H₈-VA释放进入血液的量相对增加,血液中²H₈-VA的浓度增加,更易于被仪器检测,D：H丰度比值也相应提高。构建的同位素稀释-HPLC-GC/NCI/MS检测技术已应用于近100份实际人群血清样本的分析中。样本中标记和未标记VA色谱峰清晰可见(见图 4)。

图4

Fig. 4

图4 受试者血清样本中VA和氘化VA的色谱图及质谱图 Fig.4 Chromatograms and mass spectra of VA and derivatized VA in the serum a. chromatogram of m/z 268; b. chromatogram of m/z 276; c. mass spectrum at retention time of 12.35 min.

本文建立并优化了测定人体肝脏VA储备量的稳定同位素稀释技术、气相色谱/负化学电离源/质谱(GC-NCI-MS)方法,所构建方法的稳定性、灵敏度令人满意。并且所用仪器为高效液相色谱和气相色谱/单四极杆质谱,易于实验室推广。相比国内现行的VA评价方法,此方法能更客观地反映机体VA的营养状态。