色谱  2016, Vol. 34 Issue (5): 512-519   PDF (1298 KB)    
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郑阳
许秀丽
纪顺利
袁飞
黄志强
杨丙成
张峰
固相萃取结合气相色谱-串联质谱法测定烟草制品中23种酯类香料
郑阳1,2, 许秀丽1, 纪顺利2, 袁飞1, 黄志强3, 杨丙成2 , 张峰1     
1. 中国检验检疫科学研究院烟草安全与控烟技术中心/食品安全研究所, 北京 100176;
2. 华东理工大学药学院, 上海 200237;
3. 湖南省南检验检疫科学技术研究院, 湖南 长沙 410004
收稿日期: 2015-12-17
基金项目: 质检公益性行业科研专项(201410088, 201310134);中国检验检疫科学研究院基本科研业务费项目(2016JK009, 2015JK008);国家质检总局科研计划项目(2014IK084);国家重大仪器设备开发专项(2012YQ14000806).
通讯作者: Tel:(010)53898008,E-mail:fengzhang@126.com(张峰);Tel:(021)64250622,E-mail:bcyang@ecust.edu.cn(杨丙成).
摘要: 利用固相萃取结合气相色谱-串联质谱(SPE-GC-MS/MS)检测技术建立了烟草制品中23种酯类香料的定量分析方法。样品以乙酸乙酯为提取溶剂,经NH2固相萃取柱(依次用甲醇和水活化)净化,用4 mL乙酸乙酯洗脱,在多反应监测(MRM)模式下进行检测。结果表明,23种香料在20.0~500.0 μ g/L范围内线性关系良好(r2 > 0.996),检出限(LOD, S/N=3)及定量限(LOQ, S/N=10)分别为1.9~13.6 μ g/kg及6.3~45.3 μ g/kg,在1、1.5、2倍定量限的加标水平下,平均回收率为62.1%~91.4%,相对标准偏差(RSD)均小于7%。该方法准确可靠、灵敏度好,适用于烟草制品中23种常用酯类香料的快速筛查与定性、定量分析。该方法为烟草中酯类物质的检测开拓了平台。
关键词: 固相萃取     气相色谱-串联质谱     酯类香料     烟草制品    
Analysis of 23 esters of flavor additive in tobacco products by gas chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid-phase extraction
ZHENG Yang1,2, XU Xiuli1, JI Shunli2, YUAN Fei1, HUANG Zhiqiang3, YANG Bingcheng2 , ZHANG Feng1     
1. Institute of Tobacco Safety and Control/Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China;
2. School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;
3. Hunan Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Changsha 410004, China
Foundation item: Public Welfare Fund of Inspection and Quarantine of China (Nos. 201410088, 201310134); Fund of Chinese Academy of Inspection and Quarantine (Nos. 2016JK009, 2015JK008); Science and Technology Project of Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of China (No. 2014IK084); National Key Scientific Instrument and Equipment Development Projects of China (No. 2012YQ14000806).
Abstract: An analytical method for the simultaneous determination of 23 esters of flavor additive in tobacco products was established based on optimized solid-phase extraction (SPE) with gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). The samples were extracted with ethyl acetate, cleaned up by an amino SPE column. After conditioning step, the extracts were eluted by 4 mL ethyl acetate, and then were determined by GC-MS/MS in multi-reaction monitoring (MRM) mode. The results showed that all the 23 ester flavor additives had good linearity in the range of 20.0-500.0 μ g/L, with the correlation coefficients (r2) better than 0.996. The limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of these additives were in the ranges of 1.9-13.6 μ g/kg and 6.3-45.3 μ g/kg, respectively. The average recoveries of the 23 analysts were in the range of 62.1%-91.4% at the spiked levels of 1, 1.5, 2 times LOQ with relative standard deviations (RSDs) typically lower than 7%. The accurate, reliable and sensitive method can be applied to the determination of the 23 esters of flavor additive in tobacco products for rapid screening and quantitative analysis. The method also offered an opportunity to detect more ester additives that may be added in tobacco products.
Key words: solid phase extraction (SPE)     gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS)     ester flavor additives     tobacco products    

烟草在加工、贮存和生产过程中需要加入保润剂、助燃剂、色素和烟用香料等添加剂,其中烟用香料是烟草制品(如卷烟、雪茄等)加工生产过程中不可或缺的重要添加剂[1]。未经处理的烟草口感苦涩,香料的加入可明显改善烟草的嗅觉和味觉,获得满意的吸食品质,同时还可赋予特征香气,使之成为烟草品牌的卖点[2, 3]。如今烟草制品的发展与香料物质的关系更加密切,随着降焦减害观点[4]的提出,焦油、烟碱的含量不断降低,烟草的香气也相应减少,因此加入烟用香料成为烟草补香的重要手段。然而烟用香料本身或其裂解产物[5, 6]也给吸烟者的健康造成了一定的威胁[7, 8, 9, 10]。美国食品药品管理局(FDA)及欧盟[11]等机构对香料添加剂的种类及在卷烟中的最高用量做了相应规定[12]。由于我国烟用香精香料质量控制标准体系尚在建设和完善中[13, 14],市场上仍存在超范围、超量使用香料添加剂的不规范现象,不仅损害了吸烟者的健康,还极易造成市场秩序的紊乱。

烟用香料根据官能团可分为酯类、醇类、醛类等[15],其中由于酯类香料[16]合成容易、原料来源广、香型多、价格便宜成为应用最多的烟用香料。英国卫生部公布的579种烟草添加剂许可名单中,包含133种酯类香料;美国烟草添加剂名单中,酯类香料约占20%以上。因此建立一种针对烟草中酯类香料的高效灵敏的检测方法至关重要。

由于香料多为挥发性物质,常用气相色谱-质谱法检测[17, 18],关于应用液相色谱法[19]、液相色谱-质谱法[20]的报道则较少。Merckel等[21]应用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱法(HS-SPME-GC/MS)测定了卷烟中17种常用香料,其中包括肉桂酸甲酯和苯甲酸苄酯,检出限分别为1.2 mg/kg和0.2 mg/kg,检出限较高,无法满足部分痕量香料的检测要求。Schubert等[22]运用GC/MS对水烟中11种香料进行了定量分析,其中2-甲基丁酸乙酯和乙酸苄酯的定量限分别为0.585 mg/kg和1.123 mg/kg,定量限较高。鉴于国内外针对酯类烟用香料检测方法的报道较少,本文利用固相萃取[23, 24, 25]结合气相色谱-串联质谱[26, 27, 28](SPE-GC-MS/MS)建立了烟草制品中23种酯类烟用香料的检测方法,并取得了良好的效果。其中,固相萃取能够对样品进行有效的分离、净化和富集,而GC-MS/MS法定性和定量准确、抗基质干扰强、检测灵敏度高、稳定性好。该方法可为烟草制品中酯类香料的安全控制提供技术支持。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂及材料

Agilent 7890-7000C三重四极杆气相色谱-质谱联用仪(GC-MS/MS),涡旋混合仪(美国Scientific Industries公司);KQ-500DE数控超声波清洗器(中国昆山超声仪器有限公司);Avanti J-26 XPI离心机(美国Beckman Coulter公司);超纯水系统(美国Millipore Milli-Q Gradient公司);N-丙基乙二胺固相萃取柱(Sep-Pak PSA)、弗罗里硅土固相萃取柱(Sep-Pak Florisil)、氰基固相萃取柱(Sep-Pak CN)、氨基固相萃取柱(Sep-Pak NH2)(500 mg/6 mL,美国Waters公司)。

正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、环己烷均为色谱纯(美国Fisher Scientific公司)。乙酰丙酸乙酯(ethyl levulinate)、丙酸香茅酯(citronellyl propionate)、乙酸苄酯(benzyl acetate)、2-甲基丁酸己酯(hexyl-2-methylbutyrate)、苯乙酸乙酯(ethyl phenylacetate)、棕榈酸乙酯(ethyl palmitate)、甲酸香草酯(citronellyl formate)、庚酸丁酯(butyl enanthate)、肉桂酸甲酯(methyl cinnamate)、乙酸庚酯(heptanyl acetate)均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司,乙酸薄荷酯(menthyl acetate)、肉桂酸乙酯(ethyl cinnamate)、肉桂酸正丙酯(propyl cinnamate)、乙酸香茅酯(citronellyl acetate)、正丁酸桂酯(cinnamyl butanoate)、乙酸香叶酯(geranyl acetate)、苯乙酸异丁酯(isobutyl phenylacetate)、乙酸桂酯(cinnamyl acetate)、二氢猕猴桃内酯(dihydroactinidiolide)、乙酸异丁香酚酯(acetyl isoeugenol)、苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)、肉豆蔻酸乙酯(ethyl myristate)、肉桂酸苄酯(benzyl cinnamate)均购于美国Sigma公司。所有标准品纯度均≥99%。

未经加工的烤烟叶片(不含待测目标物)研磨成粉后作为空白样品;11种商品卷烟作为实际样品。

1.2 标准溶液的配制

分别称取23种标准品10 mg(精确至±0.001 mg),用正己烷溶解,定容于10 mL容量瓶中,配制成质量浓度为1 g/L的单标储备液;将单标储备液混合、稀释,配制成质量浓度为5.0 mg/L的混合标准储备液,于4 ℃冰箱中避光保存。使用前根据需要将混合标准储备液用正己烷稀释至所需浓度,系列标准液的质量浓度分别为5.0、10.0、50.0、100.0、300.0、500.0 μg/L。

基质匹配标准溶液:将空白样品按1.3节进行前处理,氮气吹至近干后,分别用1.0 mL系列标准液进行复溶,过0.22 μm有机滤膜,待GC-MS/MS测定。

称取适量空白样品,添加不同质量浓度的混合标准储备液，配制加标空白样品,含量分别为50、100 μg/kg，静置1 h后，待用。

1.3 样品前处理

卷烟样品按照YC/T 31-1996[29]进行处理,于35 ℃恒温箱中干燥2 h,以除去水分,再研磨过筛,避光保存。

精确称取待测样品1.000 g(±0.001 g),置于50 mL聚丙烯塑料离心管内,加入20 mL乙酸乙酯萃取,涡旋1 min后,于20 ℃、100 Hz下超声25 min,于4 ℃下以8000 r/min离心10 min。吸取上清液10 mL至100 mL梨形瓶中,于45 ℃减压蒸馏至近干,用正己烷溶解、稀释后进行SPE净化。依次用5 mL甲醇和去离子水活化Sep-Pak NH2固相萃取柱,上样后用4 mL乙酸乙酯洗脱。洗脱液经氮气吹至近干,用1 mL正己烷复溶后,过0.22 μm有机滤膜,转移至色谱分析瓶中,待GC-MS/MS分析测定。

1.4 GC-MS/MS条件
1.4.1 色谱条件

色谱柱:Agilent DB-5MS弹性石英毛细管(30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气:高纯氦气;流速:1.0 mL/min;不分流进样;进样量:1 μL;溶剂延迟:5 min;进样口温度:250 ℃;色谱柱程序升温:初始温度50 ℃,以10 ℃/min升至250 ℃;分析时间:20 min。质量浓度为0.5 mg/L的23种酯类香料标准物质的总离子流图如图 1所示。

图1 23种酯类香料标准物质(0.5 mg/L)的总离子流图 Fig.1 Total ion chromatogram of the 23 esters of flavor additive (0.5 mg/L) 1. ethyl levulinate; 2. heptanyl acetate; 3. benzyl acetate; 4. hexyl-2-methylbutyrate; 5 ethyl phenylacetate; 6. citronellyl formate; 7. butyl enanthate; 8. menthyl acetate; 9. citronellyl acetate; 10. geranyl acetate; 11. methyl cinnamate; 12. isobutyl phenylacetate; 13. citronellyl propionate; 14. cinnamyl acetate; 15. ethyl cinnamate; 16. dihydroactinidiolide; 17. propyl cinnamate; 18. acetyl isoeugenol; 19. cinnamyl butanoate; 20. benzyl benzoate; 21. ethyl myristate; 22. ethyl palmitate; 23. benzyl cinnamate.
1.4.2 质谱条件

电子轰击离子(EI)源;监测模式：多反应监测(MRM)模式;离子源温度:230 ℃;电离能量:70 eV;四极杆温度:150 ℃;传输线温度:280 ℃;碰撞气:氩气。

2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化

对含有23个目标分析物的混合标准溶液进行全扫描,扫描范围为m/z 40～400,获得一级质谱图。通过选择具有高选择性的质荷比较大的和高灵敏度的相对丰度较大的离子确定各个待测物的母离子。采用产物离子扫描模式对选定的母离子进行二级裂解扫描,获得二级质谱图,并确定产物的子离子。

将碰撞能量分别设为5、10、15、20、25、30、35 eV,分析不同碰撞能量下母离子裂解的质谱图。选择在母离子不被全部打碎且子离子的相对丰度最优的条件下,响应信号最强的母离子/子离子对应的碰撞能量。在此碰撞能量附近微调,进行二次优化,得到最优的碰撞能量。23种酯类香料的保留时间及质谱参数见表 1。

表1 23种酯类香料的保留时间(tR)及质谱参数 Table 1 Retention times (tR) and MS parameters of the 23 esters of flavor additive
2.2 提取溶剂的优化

提取溶剂是影响提取效率的关键因素,提取溶剂的极性与目标物越接近,目标物在溶剂中的溶解度越大,越易被提取。本实验分别考察了正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇7种不同极性的溶剂对100 μg/kg加标空白样品提取效率的影响。结果表明,丙酮作为提取溶剂时,乙酸苄酯、乙酸薄荷酯、肉桂酸乙酯的回收率均低于60%;正己烷作为提取溶剂时,庚酸丁酯、二氢猕猴桃内酯的回收率均低于60%;甲醇、乙醇等作为提取溶剂时,各物质的回收率为60.6%～85.3%;乙酸乙酯作为提取溶剂时,各物质的回收率为73.1%～93.0%。综合考虑，乙酸乙酯对23种化合物均具有较高的提取效率,因此本实验选择乙酸乙酯作为提取溶剂。乙酸乙酯作为提取溶剂时,脂肪族羧酸酯、芳香族羧酸酯、含烯及炔不饱和键的羧酸酯中6种代表性化合物(乙酸苄酯、2-甲基丁酸己酯、丙酸香茅酯、乙酸异丁香酚酯、苯甲酸苄酯、肉桂酸苄酯)的回收率如图 2所示。

图2 提取溶剂对6种代表性酯类香料回收率的影响(n=3) Fig.2 Effect of extraction solvent on the recoveries of the six typical ester flavor additives (n=3)
2.3 提取时间的优化

提取时间是影响提取回收率的另一关键因素。提取时间过短,目标物提取不完全；提取时间过长则可能导致目标物分解,降低提取效率。本实验考察了提取时间为5、15、25、30、35 min时,100 μg/kg加标空白样品的提取回收率。结果表明,提取时间从5 min升至25 min时,提取回收率随之提高;提取时间从25 min升至35 min时,二氢猕猴桃内酯、肉豆蔻酸乙酯和乙酰异丁香酚酯的提取回收率升高，其余20种目标物在25 min时提取回收率最高。因此本实验最终确定提取时间为25 min,23种酯类香料的回收率为82.1%～92.2%,其中6种代表性酯类香料的回收率如图 3所示。

图3 提取时间对6种代表性酯类香料回收率的影响(n=3) Fig.3 Effect of extraction time on the recoveries of the six typical ester flavor additives (n=3)
2.4 固相萃取条件的优化
2.4.1 固相萃取柱的选择

目标分析物具有中等极性,适于正相固相萃取。本研究分别考察了4种常用正相固相萃取柱(NH2柱、PSA柱、Florisil柱及CN柱)对提取回收率的影响。分别用不同的固相萃取柱对50 μg/kg加标空白样品进行净化,收集上样液和洗脱液,用GC-MS/MS分析。首先将收集的上样液进行色谱分析,结果在上样液中均未检测到目标物，说明上样阶段均未穿透。随后考察了4种萃取柱对23种目标物回收率的影响。结果表明,CN柱对乙酸苄酯及2-甲基丁酸己酯的回收率均低于60%;Florisil柱对苯甲酸苄酯、肉桂酸苄酯的回收率均低于60%;PSA柱对乙酸苄酯的回收率仅为48%;NH2柱对23种酯类香料的回收率为81%～99%。因此本实验选择NH2柱作为固相萃取柱。不同固相萃取柱对6种代表性酯类香料回收率的影响如图 4所示。

图4 固相萃取柱对6种代表性酯类香料回收率的影响(n=3) Fig.4 Effect of SPE column on the recoveries of the six typical ester flavor additives (n=3)
2.4.2 洗脱溶剂的选择

本实验考察了不同洗脱溶剂(乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷和环己烷)对50 μg/kg加标空白样品回收率的影响。结果表明,当正己烷和环己烷为洗脱溶剂时,23种酯类香料的回收率均低于10%;当二氯甲烷为洗脱溶剂时,乙酸苄酯、正丁酸桂酯等5种目标物的回收率均约为30%;当乙酸乙酯为洗脱溶剂时,23种目标物的回收率均达80%以上,满足分析要求。因此本实验最终选择乙酸乙酯作为固相萃取的洗脱溶剂。

2.4.3 洗脱溶剂体积的选择

本实验考察了不同体积(1、2、3、4、5 mL)的洗脱溶剂对50 μg/kg加标空白样品回收率的影响。结果表明,当洗脱体积小于4 mL时,目标物的回收率随洗脱体积的增加而增大;当洗脱体积为4 mL时,目标物的回收率均高于90%;当洗脱体积为5 mL时,目标物的回收率基本保持不变。因此本实验最终将洗脱溶剂的体积设为4 mL。不同洗脱体积对6种代表性酯类香料回收率的影响如图 5所示。

图5 洗脱体积对6种代表性酯类香料回收率的影响(n=3) Fig.5 Effect of elution volume on the recoveries of the six typical ester flavor additives (n=3)
2.5 线性关系、检出限和定量限

配制含有23种酯类香料的基质匹配标准溶液,以目标物组分的峰面积(Y)为纵坐标,对应的质量浓度(X,μg/L)为横坐标绘制标准曲线。23种酯类香料在20.0～500.0 μg/L的质量浓度范围内,相关系数(r2)均大于0.996。在空白样品中添加低浓度的混合标准储备液,测定检出限和定量限,检出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)分别为1.9～13.6 μg/kg和6.3～45.3 μg/kg。取100.0 μg/L的基质匹配标准溶液在同一天内连续进样6次,测得日内精密度为0.9%～3.4%;每天进样1次,连续6天,测得日间精密度为1.9%～5.0%(见表 2。)

表2 23种酯类香料的线性范围、回归方程、相关系数(r2)、检出限、定量限、日内和日间精密度(n=6) Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), LODs, LOQs, intra-day and inter-day precisions of the 23 esters of flavor additive (n=6)
2.6 回收率与精密度

在空白样品中添加各酯类香料1、1.5和2倍定量限浓度水平的混合标准溶液,进行加标回收率测定,在不同的添加水平下,23种酯类香料的回收率为62.1%～91.4%,相对标准偏差均小于7%(见表 3)。

表3 23种酯类香料的平均加标回收率及相对标准偏差(n=6) Table 3 Average spiked recoveries and RSDs of the 23 esters of flavor additive (n=6)
2.7 实际样品的测定

用本实验建立的方法对11种卷烟样品(T1～T11)进行测定,每个样品重复6次,结果见表 4。由表 4可知,11种卷烟样品中均不同程度地含有部分酯类香料。

表4 卷烟样品中23种酯类香料的含量(n=6) Table 4 Contents of the 23 esters of flavor additive in tobacco samples (n=6)
3 结论

本文建立了一种SPE-GC-MS/MS法同时测定烟草制品中23种常用酯类香料的检测方法。该方法准确度高、灵敏度好、检出限低,能够满足实际样品的检测要求。本文建立的分析方法对烟草制品中酯类香料的检测和监控具有十分重要的意义。由于酯类物质具有相似的结构特征,因此可运用该方法对更多的酯类物质进行分析检测,为酯类物质的检测开拓了平台。

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