氨水(质量分数28%)、乙醇均为分析纯(上海润捷公司);乙腈(acetonitrile,ACN)和甲醇均为色谱纯(美国Tedia公司)。

γ-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)、AIBN、POSS均购自美国Aldrich公司;THF、氢氧化钠、甲酸铵(ammonium fomate)、硝基苯胺类化合物(硫脲(thiourea)、邻硝基苯胺(o-nitroaniline)、间硝基苯胺(m-nitroaniline)、对硝基苯胺(p-nitroaniline))、甲苯(toluene)、胺类化合物(对甲苯胺(p-toluidine)、烟酰胺(nicotinamide)、AM)均购自中国医药集团上海化学试剂有限公司;胸腺嘧啶(thymine)、尿嘧啶(uracil)、腺苷(adenosine)、次黄嘌呤(hypoxanthine)、尿苷(uridine)、肌苷(inosine)、鸟苷(guanosine)均购自北京百灵威科技有限公司。

TriSep^TM 2100加压毛细管电色谱仪包括柱上紫外检测器、微流控系统、溶剂输送系统、高压电源和数据采集系统(美国Unimicro Technologies公司);场发射扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)(美国FEI公司); KQ2200B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);涡旋混合器(美国Thermo Fisher公司); Milli-Q纯净水(德国默克密理博公司);石英毛细管空管柱(河北永年锐沣色谱器件公司)。

在制备整体柱之前,用γ-MAPS对毛细管空管进行硅烷化预处理^[10]。称取0.6 g THF和0.1 g AM于4 mL玻璃试管中,在涡旋混合器上混合均匀,超声10 min至澄清透明状态;称取0.02 g POSS加入试管中制备反应液,混匀,超声10 min至澄清透明状态;称取0.007 g AIBN加入上述反应液中,旋涡混匀,再超声10 min至澄清透明;通入氮气5 min,除去氧气。将上述混合液吸进预处理好的空毛细管(约32 cm)中,长度约12 cm。用硅胶密封毛细管柱的两端,在60 ℃恒温水浴中反应20 h。反应结束后,用甲醇冲洗,除去未反应的致孔剂,用电热丝在柱床之后2 mm处的空管上烧出检测窗口。

所有实验均在室温下进行,在cLC分离模式下,根据公式 ^[11]计算以甲醇为流动相时整体柱的渗透率K(其中μ为溶剂通过整体柱的线性流速,η为甲醇在室温下的动态黏滞系数(0.58×10^-3 Pa·s)^[12],L为整体柱的实际柱床长度,ΔP为整体柱两端的压力差)。

毛细管整体柱:100 mm(总长300 mm)×100 μm;分流管:2 m×50 μm;分流比:100:1;进样量:10 nL;检测波长:254 nm。流动相在使用前用0.44 μm滤膜抽滤后,超声排气20 min。

核苷碱基类化合物：pCEC模式；流动相为含有60 mmol/L甲酸铵的乙腈-水(95：5,v/v)溶液；pH为7.0；泵流速为0.02 mL/min。 甲苯和胺类化合物：cLC模式；流动相为含有10 mmol/L甲酸铵的乙腈-水(97：3,v/v)溶液；pH为5.0；泵流速为0.045 mL/min。 硝基苯胺类化合物：cLC模式；流动相为乙腈-水(3：2,v/v)溶液；泵流速为0.045 mL/min。

将核苷类、胺类、硝基苯胺类化合物溶解于50%(v/v)乙腈水溶液中,配制成质量浓度为10 g/L的样品母液,于4 ℃冰箱中保存。进样前用流动相稀释至所需浓度,经0.22 μm滤膜过滤。

本实验考察了在cLC模式下,分离甲苯时,致孔剂和功能单体的质量比对杂化整体柱的柱效和渗透率的影响,结果如表 1所示。参照文献^[13],将AIBN设为总质量的0.1%,POSS和AM的质量比设为1.0:6.0,功能单体与致孔剂的质量比分别设为1.0:7.0、1.0:6.5、1.0:6.0、1.0:5.5、1.0:5.0和1.0:4.5,制作6组(A、B、C、D、E、F)反应液。由于A组中功能单体含量太低、F组中POSS无法溶解,均未制成整体柱。随着致孔剂含量的降低,柱效逐步升高。当致孔剂的含量降低至功能单体的5倍时(E组),柱效达到最高(17 200块/m),渗透性最低。因此本研究将功能单体与致孔剂的质量比设为1.0:5.0。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 功能单体和致孔剂的质量比对柱效和渗透率的影响 Table 1 Effect of the mass ratio of monomer and porogen on column efficiency and permeability No. Mass ratio of monomer to porogen Mass ratio of POSS to AM KMeOH/(10-14 m2) Column efficiency/(plate/m) A 1.0:7.0 1.0:6.0 * failure in reaction B 1.0:6.5 1.0:6.0 1.626 14260 C 1.0:6.0 1.0:6.0 1.584 14910 D 1.0:5.5 1.0:6.0 1.542 15450 E 1.0:5.0 1.0:6.0 1.438 17200 F 1.0:4.5 1.0:6.0 * failure in solvation G 1.0:5.0 1.0:6.5 1.442 16890 E 1.0:5.0 1.0:6.0 1.438 17200 H 1.0:5.0 1.0:5.5 1.268 27300 I 1.0:5.0 1.0:5.0 1.078 38830 J 1.0:5.0 1.0:4.5 * failure in solvation * The data were not available. KMeOH: permeability detected with MeOH; mobile phase: methanol; pump flow rate: 0.03 mL/min.

表1 功能单体和致孔剂的质量比对柱效和渗透率的影响 Table 1 Effect of the mass ratio of monomer and porogen on column efficiency and permeability

本实验还考察了功能单体中POSS与AM的质量比对整体柱的柱效和渗透率的影响,结果如表 1所示。将单体和致孔剂的质量比设为1.0:5.0,POSS与AM的质量比分别设为1.0:6.5、1.0:6.0、1.0:5.5、1.0:5.0、1.0:4.5,制作5组(G、E、H、I、J)反应液。随着POSS含量的提高,柱效也随之提高,最高达到38 830块/m(I组),而随着柱子更加密实,渗透率略微下降。继续提高POSS的含量,反应液J达到饱和状态,单体无法完全溶解,未能制成均匀的整体柱。综合考虑柱效与渗透性,本研究最终将POSS和AM的质量比设为1.0:5.0。

经优化配比后,制备的poly(POSS-co-AM)整体柱与石英毛细管壁结合紧密,内部孔隙均匀,又兼有微米级别的贯穿孔,使得整体柱拥有较好的通透性。Poly(POSS-co-AM)整体柱I的场发射扫描电镜如图 1所示。

图1

Fig. 1

图1 Poly(POSS-co-AM)整体柱Ⅰ的场发射扫描电镜照片 Fig.1 SEM photographs of the poly(POSS-co-AM) monolithic column Ⅰ

在cLC模式下,对整体柱I的色谱性能进行研究,测定不同线性流速下AM的柱效。拟合范德姆特方程曲线,结果如图 2所示。当线性流速达到1.02 mm/s时,AM的理论塔板高度为11.3 μm,最高柱效为88 290块/m。

图2

Fig. 2

图2 Poly(POSS-co-AM)整体柱Ⅰ的范德姆特曲线 Fig.2 Van Deemter plot of poly(POSS-co-AM) column Ⅰ Conditions: cLC mode; mobile phase, ACN-H2O (97:3, v/v).

在cLC模式下,选择甲苯和AM作为样品,测定poly(POSS-co-AM)整体柱的保留时间与峰面积的相对标准偏差(RSD),如表 2所示。结果表明,日内、日间及整体柱之间的RSD均小于5%,本研究制备的整体柱的重复性和稳定性良好。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 Poly(POSS-co-AM)整体柱Ⅰ的保留时间与峰面积的相对标准偏差 Table 2 RSDs of retention time and peak area on monolithic column Ⅰ Item RSDs of retention time/% RSDs of peak area/% Toluene AM Toluene AM Run-to-run ( n=5) 0.17 0.32 0.42 0.83 Day-to-day ( n=3) 0.69 2.63 1.02 1.81 Column-to-column ( n=6) 1.84 3.50 2.58 3.42

表2 Poly(POSS-co-AM)整体柱Ⅰ的保留时间与峰面积的相对标准偏差 Table 2 RSDs of retention time and peak area on monolithic column Ⅰ

亲水作用色谱(HILIC)的分离机理^[14]为多种机理共同作用,如偶极矩、吸附以及氢键为初级作用机理,静电吸附为二级作用机理。HILIC的分离机理受许多条件的影响,主要为固定相的种类、流动相的pH值、流动相中有机相的含量和缓冲盐的浓度等^[15]。

为了研究poly(POSS-co-AM)整体柱的分离机理,本研究选择极性相差较大的甲苯和硫脲作为样品,通过改变乙腈在流动相中的体积分数,研究保留时间的变化趋势,结果如图 3所示。硫脲的保留时间随流动相中乙腈体积分数的增加而增加,当乙腈的体积分数超过80%时,保留时间比甲苯长;甲苯的保留时间随流动相中乙腈体积分数的增加而降低,当乙腈体积分数高于80%时,保留时间比硫脲短。结果表明,当乙腈体积分数小于80%时,反相色谱机理占主导;当乙腈的体积分数大于80%时,整体柱呈现亲水作用机理^[16]。

图3

Fig. 3

图3 流动相中乙腈的体积分数对甲苯和硫脲保留时间的影响 Fig.3 Effect of volume percentage of ACN on theretention times of toluene and thiourea Conditions: cLC mode; pump flow rate, 0.45 mL/min.

Poly(POSS-co-AM)整体柱的固定相表面含有氨基,在一定条件下能质子化为带正电的铵根离子,在分离极性带电物质时提供亲水作用以及静电相互作用。本研究选择极性较强的核苷碱基带电化合物进行评估。由于核苷碱基化合物具有强极性,很难在反相色谱(RPLC)模式下得到良好分离,因此,本研究在亲水色谱模式下,分别对乙腈的体积分数、水相中缓冲盐的浓度、流动相的pH值和施加电压进行优化,实现对核苷碱基类物质的分离。

流动相中有机溶剂的浓度对极性化合物的选择性具有很大影响，随着有机改性剂含量的增加,极性化合物与固定相之间的亲水作用增强。本研究考察了流动相中乙腈的体积分数对保留因子的影响,结果如图 4所示。随着流动相中乙腈的体积分数从87%增加到97%,7种核苷碱基化合物的保留因子也随之增大。当乙腈的体积分数为97%时,各物质保留太强,峰形较差,互相重叠,难以分离;当乙腈的体积分数为87%时,7种核苷碱基化合物的保留时间太接近,无法分离;当乙腈的体积分数为95%时,各物质均实现基线分离,且峰形可接受。因此，本研究在分离核苷类化合物时,将乙腈的体积分数设为95%。

图4

Fig. 4

图4 流动相中乙腈的体积分数对核苷碱基化合物保留因子的影响 Fig.4 Effect of volume percentage of ACN on the retention factors of nucleosides Conditions: cLC mode; pump flow rate, 0.02 mL/min.

本研究还考察了流动相水相中缓冲盐甲酸铵的浓度对样品保留因子的影响。将缓冲盐的浓度从10 mmol/L逐渐升高至110 mmol/L,随着缓冲盐浓度的增加,核苷碱基类化合物的保留因子先变大后变小。当甲酸铵浓度为60 mmol/L时,核苷碱基类样品的保留因子达到最大值。两种效果相反的分离机理共同作用,随着缓冲盐浓度的增大,固定相的容积也增大,核苷类化合物的保留因子随之增大;随着离子强度的增大,流动相的洗脱能力增大,核苷类化合物的保留因子变小。综合考虑,本研究选择将水相中缓冲盐的浓度设为60 mmol/L。

本研究还考察了流动相pH值对核苷碱基类样品保留因子的影响。在cLC模式下,随着流动相pH从4.0逐渐增至9.0,7种核苷碱基类样品的保留因子呈现先变大后变小的趋势。当流动相pH为7.0时,7种核苷碱基类样品的保留因子最大。因为随着流动相pH的增大,样品正电性减小,与铵根离子的排斥力减小,保留增大;又由于正电性的减小使物质的亲水作用减弱,因而保留时间减小。综合考虑,本研究选择将流动相pH设为7.0。

在pCEC模式下,整体柱进口端接地,出口端施加正电压,分离7种核苷碱基化合物(见图 5)。当施加电压为10 kV时,分离速度提高,柱效增加,7种核苷碱基化合物均实现了基线分离;当电压提高至15 kV时,分离度减小。因此,在pCEC模式下,本实验将分离电压设为+10 kV。

图5

Fig. 5

图5 在poly(POSS-co-AM)整体柱上分离电压对核苷类化合物分离效果的影响 Fig.5 Effect of separation voltage on separation effect of nucleosides on a poly(POSS-co-AM) monolithic column Peaks: 1. thymine; 2. uracil; 3. adenosine; 4. hypoxanthine; 5. uridine; 6. inosine; 7. guanosine.

在亲水色谱模式下,poly(POSS-co-AM)整体柱分离甲苯和3种胺类化合物的色谱图,如图 6所示。随着胺类化合物极性的增加,4种化合物的保留因子和响应强度依次变大,出峰顺序与文献报道^[17]一致。其中烟酰胺的柱效可达171 350块/m。

图6

Fig. 6

图6 Poly(POSS-co-AM)整体柱分离4种化合物的色谱图 Fig.6 Chromatogram of four compounds by a poly(POSS-co-AM) monolithic column Conditions: cLC mode; mobile phase, ACN-H2O (97:3, v/v) containing 10 mmol/L ammonium fomate; pH 5.0. Peaks: 1. toluene; 2. p-toluidine; 3. acrylamide; 4. nicotinamide.

Poly(POSS-co-AM)整体柱分离4种硝基苯胺类化合物的色谱图,如图 7所示。在60%(v/v)乙腈水溶液条件下,硫脲、对硝基苯胺、间硝基苯胺、邻硝基苯胺随着极性的减小,保留因子依次增大。结果表明,poly(POSS-co-AM)整体柱的保留行为为反相色谱模式。

图7

Fig. 7

图7 Poly(POSS-co-AM)整体柱分离4种硝基苯胺类化合物的色谱图 Fig.7 Chromatogram of four nitrobenzene amines by a poly(POSS-co-AM) monolithic column Conditions: cLC mode; mobile phase, ACN-H2O (3:2, v/v); pump folw rate, 0.045 mL/min.. Peaks: 1. thiourea; 2. p-nitroaniline; 3. m-nitroaniline; 4. o-nitroaniline.

本文以八乙烯基倍半硅氧烷(POSS)为交联剂,丙烯酰胺(AM)为单体,四氢呋喃(THF)为致孔剂,偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂,制备了一种新型有机-无机杂化整体柱。该整体柱孔径均匀,渗透性好,反压低,分离速度快,柱效高,并具有良好的亲水性和重现性。既能较好地在亲水色谱模式下分离极性较大的核苷碱基及胺类化合物,也能在反相色谱模式下分离极性较小的硝基苯胺类化合物。该研究为杂化整体柱的研究与发展提供了科学借鉴。