柱切换-高效液相色谱系统:2个LC-6A泵、SPD-6AV紫外检测器、CTO-6A柱温箱、SCL-6A色谱信号控制器(日本岛津公司); 7725i进样阀和7000型切换阀(美国Rheodyne公司); SK5200H超声波清洗器(天津奥特赛恩思仪器有限公司); TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂); AE-240电子天平(上海Mettler Toledo公司);限进性填料柱(45 mm×4.6 mm, 5 μ m;实验室自制);分析柱(Luna C₁₈, 250 mm×4.6 mm, 5 μ m;美国Phenomenex公司)。

甲醇为分析纯试剂(四川西陇化工有限公司,批号:120319),水为灭菌注射用水(四川科伦药业股份有限公司,批号:H20044405),盐酸贝那普利对照品(中国食品药品检定研究所,批号:100768-201102)，盐酸贝那普利片(北京诺华制药有限公司,批号:H20030514)。

预处理流动相:水-甲醇(95 ∶ 5, v/v),流速:1 mL/min。分析流动相:甲醇-水(60 ∶ 40, v/v)含体积分数为0.03%的甲酸,流速:1 mL/min。柱温:25 ℃;检测波长:239 nm。

精密称量 0.0200 g盐酸贝那普利对照品于10 mL的容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配成2 mg/mL 的盐酸贝那普利储备液。

随机选取Wistar大鼠6只,体重在200～220 g之间,自由饮水。禁食12 h后,给予盐酸贝那普利片剂,按10 mg/kg 剂量灌胃。参考人体药动学参数,设计给药后采血时间,分别于0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24 h经大鼠眼球后静脉丛采血0.5 mL,置于肝素化试管中。在 5000 r/min 的速率下离心5 min,取上清液于-40 ℃冷冻保存备用。测定时,室温融解,上清液直接进样。

设计了柱切换方法,改变流动相走向,实现分析物与蛋白质的分离,达到纯化与富集的目的,进而完成对分析物的测定。

如图2a所示,经大体积进样,样品中的蛋白质等大分子杂质随预处理流动相除去,而小分子物质被富集在限进柱上;待蛋白质除完后,再将切换阀切换至如图2b所示,使限进柱与分析柱呈串联状态,被富集在限进柱上的小分子物质随分析流动相洗脱至分析柱进行分离,从而达到降低HPLC检出限的目的。分析完毕后,将阀切换至初始状态(图2a),用预处理流动相和分析流动相分别冲洗限进柱和分析柱5 min,以便下次进样。

图2

Fig. 2

图 2 (a)在线富集及(b)分析的示意图 Fig. 2 Schematic diagrams of (a) online preconcentration and (b) analysis

在本实验色谱条件下对空白血浆、空白血浆中添加盐酸贝那普利对照品及给药1 h后血浆样品的色谱图进行比较(见图3)。检测波长为239 nm,盐酸贝那普利的出峰时间为19.6 min。结果显示血浆中无内源性杂质干扰,不会影响盐酸贝那普利样品的测定。

图3

Fig. 3

图 3 (a)空白血浆、(b)空白血浆加对照品、(c)给药后血浆样品的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of (a) blank plasma, (b) spiked blank plasma and (c) plasma after administration Peak: 1. benazepril hydrochloride.

配制质量浓度为5 μ g/mL 的盐酸贝那普利空白血浆加标溶液,以不同体积(20、40、60、80、100、120、140 μ L)进样,以峰面积对进样体积作图(见图4),考察峰面积与进样体积的关系。由图4可见,进样量在100 μ L以内时,峰面积随进样量的增加而增加;当进样量大于100 μ L时,峰面积不再随进样量的增加而增加,这是因为进样体积超出了限进柱的最大进样体积。当限进柱中充满过多样品时,不是所有的样品都能与限进性填料充分接触,因而降低了限进性填料对小分子物质的萃取能力,使得峰面积不再随进样量的增加而增加。因此,在本实验方法下,自制RAM柱长度在45 mm时,考虑限进柱对样品的保留能力,选择100 μ L为盐酸贝那普利的最大进样体积。

图4

Fig. 4

图 4 峰面积与进样体积的关系 Fig. 4 Relationship between peak area and injection volume

为使色谱柱有效地分离,应该考虑色谱分离体系的耐压能力,故在本实验中考察了大体积进样对系统总压力的影响。分别进样20、40、60、80、100、120、140 μ L,记录色谱系统的压力,以进样体积和系统总压力作图。由图5可见,进样体积大于80 μ L时,系统总压力的变化明显,鉴于对整个系统的保护和色谱体系的耐压能力,选择80 μ L作为最大进样体积。

图5

Fig. 5

图 5 系统总压力与进样体积的关系 Fig. 5 Relationship between systematic pressure and injection volume

为了证明RAM-HPLC在线富集的可行性,我们设计进行了下述实验:配制10 μ g/mL 的盐酸贝那普利空白血浆加标溶液,分别进样20和80 μ L(见图6)。平行测定5次,结果见表1。理论上,当浓度相同时,峰面积与进样体积成正比。因此,同一浓度的样品进样体积相差4倍,则所得峰面积也应相差4倍。图6a中的盐酸贝那普利(进样量为20 μ L, 10 μ g/mL)峰是一个微小的吸收峰,图6b盐酸贝那普利(进样量为80 μ L, 10 μ g/mL)峰是一个尖锐的吸收峰。由此可见,限进柱可以对样品中低含量物质起到富集作用。根据表1中的平均峰面积数值计算,图6b中的峰面积是图6a中峰面积的4.2倍,与4倍的理论值非常接近。结果表明RAM-HPLC对样品中盐酸贝那普利的在线富集是可行的,且富集后的峰形良好,适合检测血样中低含量的盐酸贝那普利。

图6

Fig. 6

图 6 常规进样和大体积进样的空白血浆加标(10 μ g/mL)样品色谱图 Fig. 6 Chromatograms of spiked (10 μ g/mL) blank plasma using ordinary injection and large volume injection Peak: 1. benazepril hydrochloride.

表 1 常规进样与大体积进样的峰面积(n=5) Table 1 Peak areas of ordinary injection and large volume injection (n=5) Injection volume/ μ L Mass concentration/ ( μ g/mL) Average peak area (n=5) RSD/% (n=5) 20 10 2266384 4.35 80 10 9508785 0.84

表 1 常规进样与大体积进样的峰面积(n=5) Table 1 Peak areas of ordinary injection and large volume injection (n=5)

根据盐酸贝那普利人体药动学参数,其半衰期是0.6 h,达峰时间(T_max)是1～1.5 h,实验设计分别测定大鼠给药后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24 h的血样中盐酸贝那普利的浓度。按照本实验所建立的方法检测,只有给药0.25、0.5、1、1.5、2 h后大鼠血浆样品中能够检测到盐酸贝那普利,其质量浓度分别为0.56、0.60、1.43(图3c)、0.85、0.23 μ g/mL;其余采血点因浓度太低,未测出。