近年来,我国由于误食抗凝血类鼠药毒饵引起的中毒事件时有发生[ 1 ]。因此建立抗凝血类鼠药准确、灵敏的测定方法十分必要。目前,关于抗凝类血鼠药的检测方法主要有薄层色谱法[ 2 ]、分光光度法[ 3 ]、高效液相色谱法[ 4, 5, 6, 7, 8 ]、气相色谱法[ 9 ]、高效液相色谱-质谱联用法[ 10, 11, 12 ]等。由于薄层色谱法、分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法的定性能力较差,难以满足抗凝血类鼠药中毒样品的快速筛查与检测需求。而高效液相色谱-质谱联用法具有定性能力强、检测灵敏度高等优点,在抗凝血类鼠药检测中已经得到了广泛的运用[ 13 ]。但其对此类鼠药的检测主要是针对一些生物样本,例如尿液、血样等,并且只测定了其中的1种或几种物质[ 14 ]。目前尚没有检索到对10种抗凝血类鼠药同时检测的报道。本文采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术,建立了同时快速筛查检测辣椒酱、面粉、醋和酱油中10种抗凝血类鼠药的方法。本方法简单、快速、灵敏度高、重现性好,能满足由此10种抗凝血类鼠药引发的突发性公共卫生安全事件的快速筛查与检测要求。
Thermo TSQ Quantum Access Max液相色谱-串联质谱仪(美国Thermo公司);萃取包粉末(QuEChERS AOAC Pouch, 6 g硫酸镁,1.5 g乙酸钠;美国Agilent公司);陶瓷均质子(Ceramic Homogenizers,美国Agilent公司);乙腈、丙酮和甲酸均为色谱纯(德国Merck公司);去离子水由Millipore公司超纯水器制得。
杀鼠醚(coumatetralyl)、杀鼠灵(warfarin)、敌鼠(diphacinone)、氯敌鼠(chlorophacinone)、溴敌隆(bromadiolone)、大隆(brodifacoum)、杀它仗(flocoumafen)、鼠得克(difenacoum)、克灭鼠(coumafuryl)、氯杀鼠灵(coumachlor)标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。
称取10种标准品各10 mg(精确到0.1 mg)分置于10 mL容量瓶中,用丙酮溶解并定容,配制成1 g/L 的标准储备液,于4 ℃下避光保存。
分别吸取各标准储备液0.1 mL于10 mL容量瓶中,用乙腈稀释并定容,配制成10 mg/L 的混合标准储备溶液,于4 ℃下避光保存。
称取3 g(精确至0.01 g)试样于50 mL具塞离心管中,加入陶瓷均质子,加水至10 mL,振荡混匀;准确加入10 mL乙腈溶液,振荡提取5 min;加入萃取包粉末,振荡混匀5 min后,以不低于 4000 r/min 速率离心5 min。上清液直接用于分析。
UPLC条件:色谱柱为Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μ m,美国Agilent公司);流动相:A为5 mmol/L 乙酸铵溶液,B为乙腈;梯度洗脱:0～0.5 min, 10%B; 0.5～5.0 min,由10%B线性增长到85%B; 5.0～6.0 min,由85%B线性增长到95%B; 6.0～6.1 min,由95%B线性下降到初始比例,平衡1.4 min结束。流速:0.3 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:3 μ L。
MS/MS条件:电喷雾电离(ESI),负离子模式;多反应监测(MRM);挥发气温度350 ℃;毛细管温度300 ℃;鞘气流量13 L/min;辅助气流量6 L/min;喷雾电压 2500 V;各特征离子及碰撞能见表1。
为了降低基质干扰、提高色谱分离的效果,分别使用中性Al2O3和QuEChERS萃取包进行净化处理并予以比较。结果表明,使用中性Al2O3时,色谱图中一些待测物质不出峰,并且色谱峰强度较低,待测组分的回收率均小于18% ,这表明中性Al2O3对待测组分的吸附作用较强;使用QuEChERS萃取包时,所有待测组分都能出峰,回收率都在70%以上,各待测物分离良好。因此,本实验选用了QuEChERS萃取包来降低基质干扰、提高色谱的分离效果。
为了进一步了解样品基质的影响,分别使用乙腈和空白基质溶液配制标准溶液制作标准曲线。试验结果表明,当使用乙腈配制标准溶液时,4种空白样品中待测组分的加标回收率在30% ～280%范围之间,例如杀鼠灵在辣椒酱中的回收率很低,只有34% ,而大隆的回收率则高达269% ;当使用空白基质溶液配制标准溶液时,4种空白样品的加标回收率均在90%左右,效果较好,因此本实验选用了空白基质溶液配制标准溶液制作标准曲线。
流动相的选择直接会影响分析的灵敏度、峰的分离度以及分析时间等。分别使用了水-乙腈、5 mmol/L 乙酸铵-乙腈、5 mmol/L 甲酸-乙腈、5 mmol/L 甲酸铵-乙腈作为流动相体系,发现流动相为5 mmol/L 乙酸铵-乙腈时,10种抗凝血类鼠药的分离度好,分析时间短,重现性好。
分别在正、负离子模式下考察了10种待测组分的质谱响应。10种鼠药在负离子模式下的响应值均高于在正离子模式下的响应值。从结构式上来看,这10种待测组分均是含有苯环与羰基的杂环化合物,由于共轭效应的影响,使得羟基上的氢原子和芳环上的氢原子活性大大提高,更容易失去质子形成负离子,在负离子模式下具有更高的响应强度,因此本实验选用负离子模式电离。
分别考察了喷雾电压、鞘气流速、辅助气流速、挥发气和毛细管温度对离子强度的影响,同时利用仪器自动优化每个化合物的碰撞能,最终选定了最优参数,其中氯杀鼠灵只有一对离子对。优化条件下10种抗凝血类鼠药的多反应监测色谱图见图1。
取空白样品按照1.3节方法处理。用所得的空白基质溶液将混合标准储备液逐级稀释得到质量浓度为5、20、100、200、500 μ g/L 的混合标准工作液,由低浓度到高浓度进样监测,以定量离子的峰面积对组分的质量浓度作图,得到基质标准回归方程。以信噪比(S/N)为3作为检出限(LOD), S/N=10作为定量限(LOQ)。
10种鼠药均在5～500 μ g/L 范围内呈现良好的线性关系,线性相关系数(r)大于0.99。在辣椒酱中的LOD和LOQ分别为0.5～4.5 μ g/kg 和2.0～17 μ g/kg;在面粉中的LOD和LOQ分别为0.5～4.0 μ g/kg 和2.0～15 μ g/kg;在醋和酱油中的LOD和LOQ分别为0.5～4.5 μ g/kg 和1.5～15 μ g/kg。
在优化的色谱-质谱条件下进行方法的回收率和精密度试验。采用空白样品加标的方式进行回收率试验。分别在样品中添加低、中、高3个浓度水平的混合标准储备液,使其添加量分别为33、330、1650 μ g/kg,再按照1.3节方法进行样品处理(处理后样品溶液中待测组分的质量浓度分别为10、100、500 μ g/L),每个浓度水平平行测定6次。在辣椒酱、面粉、醋和酱油4种样品中,10种鼠药的回收率分别为80.8% ～112% 、72.6% ～112% 、75.6% ～108%和74.8% ～112% , RSD分别为2.41% ～11.2% 、2.87% ～10.6% 、1.98% ～10.3% 和2.36% ～9.82% 。
应用本方法对一起疑似鼠药中毒事件采集的辣椒酱、面粉、醋和酱油进行了测定,其中辣椒酱中检测出溴敌隆215 μ g/kg,其余3份样品未检出此10种抗凝血类鼠药。阳性样品的色谱图见图2。
创建了一种利用超高效液相色谱-串联质谱同时快速筛查检测辣椒酱、面粉、醋和酱油4种食品中10种抗凝血类鼠药的方法,其回收率、精密度、检出限和定量限等各项技术指标均符合要求。将该方法应用于实际样品的检测,重现性良好。该方法具有操作简便、准确度好、灵敏度高等特点,适合于由此10种抗凝血类鼠药引发的突发性公共卫生安全事件的快速筛查与检测要求。
2013, Vol. 31 Issue (5): 473-476
PDF (789KB)
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