室温下,乙酰乙酸乙酯以酮-烯醇式异构体平衡的“混合物”存在;但是在不同条件下,其酮式和烯醇式异构体的比例有所变化。Burdett等^{[ 4 ]}通过研究发现,温度过高,烯醇式乙酰乙酸乙酯的分子内氢键会遭到破坏,使烯醇式异构体的稳定性降低,导致酮式异构体所占比例增大。但是在普通液相色谱柱柱温可变范围内,温度对乙酰乙酸乙酯的酮-烯醇式异构体平衡影响很小,因此可以忽略。

溶剂效应对乙酰乙酸乙酯的酮-烯醇异构体平衡影响很大。研究证明,在质子性溶剂中,烯醇式乙酰乙酸乙酯所占的比例要远低于在非质子性溶剂中烯醇式异构体所占的比例^{[ 5 ]}。这是因为质子性溶剂容易与酮式异构体形成分子间氢键,从而有利于酮式异构体的存在;而非质子性溶剂有利于分子内氢键的形成,从而有利于烯醇式异构体的存在。烯醇式乙酰乙酸乙酯在部分溶剂中所占比例见表1^{[ 15 ]}。由表1可以看出,随着溶剂极性的增大,烯醇式乙酰乙酸乙酯的含量减小；当溶剂为水时,烯醇式异构体的比例很低,为0.4% 。

表 1 烯醇式乙酰乙酸乙酯在各种溶剂中的比例[ 15 ] Table 1 Ratio of enol of ethyl acetoacetate in various solvents[ 15 ] Solvent Solvent polarity Ratio of enol/% Water 9.0 0.4 Methanol 6.6 5.8 Ethanol 5.2 10.5 Benzene 3.1 16.1 Hexane 0 39.2

表 1 烯醇式乙酰乙酸乙酯在各种溶剂中的比例[ 15 ] Table 1 Ratio of enol of ethyl acetoacetate in various solvents[ 15 ]

含有 α -氢的碳基化合物在酮-烯醇式异构体体系中烯醇式异构体的比例随其酸度系数pK_a的降低而升高^{[ 6 ]}。对于乙酰乙酸乙酯来说,溶剂中含有游离的H⁺,使乙酰乙酸乙酯的电离平衡方程式向质子化状态方向移动,从而降低其电离程度,增大了其pK_a值,最终导致烯醇式异构体的比例降低。因此酸性溶剂有利于酮式异构体的存在。

通过对乙酰乙酸乙酯酮-烯醇式异构体相互转化影响因素的研究,我们得知在极性且为酸性的溶剂中有利于酮式异构体的存在,当溶剂为水时,烯醇式异构体的含量很低,这为液相色谱流动相的选择提供了理论依据。

以甲醇作溶剂,在紫外-可见分光光度计下分别对脱氢乙酸和乙酰乙酸乙酯进行扫描,以确定最大紫外吸收波长,其紫外扫描图如图2所示。脱氢乙酸在309 nm左右有最强吸收,在225 nm左右有次强吸收。烯醇式乙酰乙酸乙酯的吸收波长归属为羰基与乙烯基共轭体系的 π→π ^*跃迁产生的K强吸收带,其最大吸收在245 nm左右;而其酮式异构体的吸收波长归属为羰基的n→π ^*跃迁产生的R弱吸收带,其最大吸收在290 nm左右^{[ 14 ]}。本实验采取将烯醇式异构体转化为酮式异构体从而避开烯醇式异构体干扰的分析方法,因此实验选择酮式异构体的吸收波长作为乙酰乙酸乙酯的吸收波长。由图2可见,脱氢乙酸在290 nm左右也有较大的吸收,综合考虑,选择290 nm作为实验的紫外检测波长。

图2

Fig. 2

图 2 (a)脱氢乙酸和(b)乙酰乙酸乙酯的紫外扫描图 Fig. 2 UV spectra of (a) dehydroacetic acid and (b) ethyl acetoacetate

对于液相色谱而言,流动相中有机溶剂的选择和配比、缓冲盐的选择和用量以及pH值的大小对物质分离的影响显著。鉴于乙酰乙酸乙酯酮-烯醇式异构体转化的影响因素的研究结果,固定其他条件,考察了以甲醇-水和乙腈-水为流动相时的分离效果。结果显示,以甲醇-水为流动相的分析效果更好。综合各方面考虑,本实验选择甲醇-水作为流动相。

固定其他条件,考察了不同比例的甲醇-水(50 ∶ 50、20 ∶ 80和5 ∶ 95, v/v)对分离效果的影响。脱氢乙酸与乙酰乙酸乙酯混合标准溶液的分离图谱如图3所示。随着流动相中甲醇比例减小,两标准品的峰形变好,分离度增大。对于乙酰乙酸乙酯来说,根据前面研究的结果,流动相中甲醇比例减小,意味着溶剂极性增大,有利于酮式异构体的存在,从而降低了烯醇式异构体的干扰,使乙酰乙酸乙酯的峰形更好,定量更准确；当甲醇-水的体积比为5 ∶ 95时,烯醇式异构体的比例很低。考虑色谱柱的使用条件及使用寿命,选择甲醇-水(5 ∶ 95, v/v)作为流动相。

图3

Fig. 3

图 3 以不同比例的甲醇-水为流动相时脱氢乙酸和乙酰乙酸乙酯的分离谱图 Fig. 3 Chromatograms of dehydroacetic acid and ethyl acetoacetate in different ratios of methanol-water as mobile phases Ratios of methanol-water: a. 50 ∶ 50; b. 20 ∶ 80; c. 5 ∶ 95.Peak identifications: 1. dehydroacetic acid; 2. ethyl acetoacetate.

固定其他条件,考察了醋酸铵、三乙胺和Na₂HPO₄ 3种缓冲盐对分离效果的影响。结果表明,在流动相中加入少量的醋酸铵可消除色谱峰拖尾,提高峰的对称性。但是缓冲盐的用量对色谱分离影响较大,试验考察了不同醋酸铵用量对色谱分离的影响,结果如表2所示。试验结果表明,醋酸铵对乙酰乙酸乙酯的峰形影响不大,但对脱氢乙酸影响较大；当加入0.3%醋酸铵时,分离效果最佳。

表 2 不同醋酸铵加入量对脱氢乙酸和乙酰乙酸乙酯分离的影响 Table 2 Effect of ammonium acetate content in mobile phase on the separation of dehydroacetic acid and ethyl acetoacetate φ (Ammonium acetate)/% Peak widths/min Resolution Dehydroacetic acid Ethyl acetoacetate 0.5 1.124 0.153 1.162 0.4 0.542 0.157 1.741 0.3 0.124 0.160 2.363 0.2 0.461 0.161 2.484

表 2 不同醋酸铵加入量对脱氢乙酸和乙酰乙酸乙酯分离的影响 Table 2 Effect of ammonium acetate content in mobile phase on the separation of dehydroacetic acid and ethyl acetoacetate

流动相pH的大小对改善峰形、提高分离度有一定的影响。固定其他条件,考察了不同流动相pH值对分离的影响。结果如表3所示,随着流动相pH值的降低,乙酰乙酸乙酯的峰形变好;但流动相pH值越小,脱氢乙酸峰形越差。综合考虑,本实验选择流动相pH=6。

表 3 流动相pH值对脱氢乙酸和乙酰乙酸乙酯色谱峰形的影响 pH Symmetry factors Dehydroacetic acid Ethyl acetoacetate 4 2.14 1.02 5 1.76 1.15 6 1.24 1.21 7 1.19 1.84 8 1.14 2.14

表 3 流动相pH值对脱氢乙酸和乙酰乙酸乙酯色谱峰形的影响 Table 3 Effect of mobile phase pH on the peak shapes of dehydroacetic acid and ethyl acetoacetate

分别考察了流速为1.0、0.8、0.6和0.4 mL/min 的情况。结果表明,流速增加,保留时间缩短,分离度降低;流速减小,保留时间延长,分离度提高,但色谱峰变宽。综合考虑分离度、保留时间和峰形等因素,流动相流速定为0.6 mL/min。