人参归脾丸(Renshen Guipi Wan, RSGPW)是由人参、白术、远志等10味药组方而成,具有益气补血、健脾养心之功效[ 1 ],主要用于气血不足、心悸、失眠等症。缪金财等[ 2 ]和尚春英等[ 3 ]用薄层色谱法(TLC)鉴别人参、白术、甘草和黄芪等来控制其质量。也有通过数字化指纹图谱[ 4 ]对其进行研究的报道。本文考虑方中含有皂苷类、黄酮类、挥发油、有机酸及多糖类等成分,组成复杂致其紫外响应差异很大,采用高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)建立多波长指纹图谱[ 5, 6 ]以实现最大限度表征多组分含量信息并真实表达其质量。目前有加权模糊识别[ 7 ]、聚类分析[ 8, 9 ]、判别分析[ 10 ]、主成分分析[ 11 ]等方法用于指纹图谱数据分析和识别,以及夹角余弦相似度评价[ 12 ]、一级系统指纹定量法[ 13 ]、系统指纹定量法[ 14, 15 ]、三级系统指纹定量法[ 16 ]等指纹图谱评价软件开发成功。本文建立了新的指纹图谱评价方法,即线性指纹定量法(linearly quantified fingerprint method, LQFM)。该方法是对系统指纹定量法的深入发展,是中药线性质量控制的新理念,是以本底制剂为对照标准,以线性思想来控制中药质量的新方法。本文用LQFM定性、定量评价RSGPW的三波长指纹图谱(THW-FPs),以每批指纹图谱的熵值单位权重整合三波长指纹谱,实现对不同批次RSGPW的有效质量控制。
虽然中药各化学成分的含量与其活性不一定存在线性关系,但是质量稳定重现的中药原料和中成药及各种新型中药化学成分本身具有恒定比例和固定含量分布,因此现代中药的化学物质组———本底模式,反映在色谱指纹图谱上则具有固定特征——标准指纹图谱模式。中药属于复杂体系,但质量稳定可控的中药体系色谱指纹图谱本身也具有固定特征,而色谱法定量的本质属性决定了峰积分与组分浓度呈线性关系,故中药复杂体系定量分析具有线性属性。本文建立LQFM控制中药质量是以本底(对照)制剂的对照指纹向量(referential fingerprint vector, RFV)Y=(y1, y2，…, yn)作自变量,样品指纹向量(sample fingerprint vector, SFV)X=(x1, x2，…, xn)作因变量,xi与yi(i≤n)为各指纹峰面积,求解中药样品X含有几个Y，即SFV包含几个RFV。合格中药本身则是按照本底模式呈多元线性变化,参照2010版药典标准和文献[ 15 ],固体制剂含量均匀度的限度在±20%内为合格；鉴于不同批次中药制剂化学成分复杂,规定整体化学物质总含量的变化幅度在±30%之内为合格。
多元组分线性定量模型:中药中的每个化学成分元存在xi=a+byi, i=1, 2, …, n。(1)首先对SFV和RFV进行属性相似度判断,用X和Y的线性相关系数r＞0.9作属于同类的初步判别(见式(1))。为消除大元素对r(0～1)的影响,将Y作Y0=(1,1,1,…,1)和X作X0=,用Y0和X0的夹角余弦S′(0～1)评价SFV对RFV的隶属度(见式(2))。整合r和S′得到线性相似度SL(0～1)(见式(3))。SL能科学地判别样品对本底模式的属性隶属度。(2)既然样品是RFV的同类样品,满足x=a+by,则斜率b是代表样品整体含量的最简表达,截距a是误差。考虑每个指纹峰的误差,则得平均含量M(质量分数)(见式(4))和各化学指纹成分含量的几何平均含量M′(质量分数)(见式(5))。为防止极大、极小峰的影响,规定。整合M和M′得到整合平均质量定量相似度M0(见式(6))。根据回归方程满足和X =a+b 可得总积分面积的百分含量R(见式(7))。整合M0和R得到线性定量相似度ML(见式(8))。ML是定量衡量样品整体含量的最有效表达,在忽略误差时可直接用b表示(见式(9))。式(9)中C为投影含量相似度[ 17 ]； ρ 为方均均方比(见式(10))。(3)X和Y分别为与均化性向量a=(1,1,1,…,1)的夹角余弦 γ X和 γ Y,分别能代表各自指纹峰大小的均等性,二者越接近则均化性越好。定义指纹均化性变动系数 α 来揭示 和 均化性差异(见式(11)), α 越小越好。式(11)中W为模长百分比[ 17 ]。(4)首先可用r、b和 α 进行简单分析,即用r和b判断批间样品的定性、定量相似度,然后再用SL、ML和 α 精确鉴别。用SL、ML和 α 相结合对中药和植物药进行精准定性和定量的方法称为LQFM。采用LQFM鉴定中药和植物药的质量，将其划分为8级(见表1)。
Agilent1100型高效液相色谱仪,包括G1379A在线脱气装置、G1311A四元低压梯度泵、G1313A自动进样器、G1315B DAD紫外检测器和ChemStation色谱工作站(美国Agilent公司); KDM型控温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司); RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);甲醇、乙腈为色谱纯(山东禹王实业有限公司);磷酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司); 95%乙醇为分析纯;水为去离子水。甘草苷(liquiritin, LQR)对照品(批号111610-200503,供含量测定用),购自中国食品药品检定研究院;10批市售人参归脾丸:编号S1～S6(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂), S7～S10(沈阳红药制药有限公司),均购于沈阳各药店。
色谱柱:Centurysil C18 BDS (200 mm×4.6 mm, 5 μ m;大连江申分离科学技术公司)。流动相:A为0.1%(v/v,下同)磷酸-水,B为0.1%磷酸-乙腈。梯度洗脱:0～80 min, 10%B～90%B; 80～85 min, 90%B。紫外检测波长:203、228和326 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:(35.00±0.15) ℃;进样量:5 μ L。
对照品溶液:称取甘草苷对照品适量,加甲醇制成500 mg/L LQR对照品溶液。
供试品溶液:取人参归脾丸1丸,精密称定,切碎,用50 mL 95%乙醇回流提取1 h,过滤;残渣用40 mL 95%乙醇回流提取30 min,过滤;合并滤液,减压浓缩至约16 mL,再用95%乙醇定容至25 mL,混匀,临用前用0.45 μ m滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
按照2.2节条件,将S1供试品溶液和LQR对照品溶液分别进样分析,通过保留时间和在线紫外光谱图,确定在203、228和326 nm检测波长下LQR分别为11号、11号和10号色谱峰(见图1)；选LQR峰作为参照物峰。依据2 h空白溶剂和2 h空针色谱图,排除其他非共有峰;依据2 h供试液色谱图确定洗脱时间为85 min。
精密吸取S1供试品溶液5 μ L,按照2.2节条件连续进样5次,考察仪器的精密度;取S1供试品溶液,分别在样品制备后0、3、6、9和12 h进样分析,考察样品溶液的稳定性;取S1号样品平行制备供试液5份,精密吸取5 μ L进样分析,考察方法的重复性。以LQR峰为参照物峰,计算各峰相对保留时间的RSD均小于1.0% ,各相对峰面积的RSD均小于4.0% ,表明仪器精密度、样品溶液稳定性及方法重复性均符合要求。
分别精密吸取10批供试品溶液5 μ L,按照2.2节条件进样分析,记录色谱图(见图2)。以甘草苷峰为参照峰,按峰出现率100%(S/N≥3)计,确定指纹峰的个数分别为38(203 nm)、37(228 nm)和37(326 nm)。以均值法分别生成三波长对照指纹谱(referential fingerprints, RFPs)见图2。
分别以203、228和326 nm检测波长下的RFPs为参照,计算知326 nm下S9及228 nm下S3、S4和S7～S10除外,其余r＞0.9。利用LQFM理论得10批样品的SL、ML及 α 并按照表1鉴定其质量,结果见表2。不同检测波长下样品的质量等级有差异,如S9在3个检测波长下的质量等级均不同;S2、S3和S10在326 nm检测波长下的质量等级与其余2个波长下的质量等级比较分别变化1、2和1级;S1、S6和S8相比均上升1级。引起差异的主要原因是不饱和化学成分的含量不同,且不同检测波长下样品多组分的紫外响应差异大,如黄酮类组分在326 nm下的吸收较好,皂苷类组分在203 nm下有响应。兼顾不同化学组分对吸收信号的贡献,多波长均值法[ 6 ]更能反映样品质量优劣。取三波长下样品的SL、ML及 α 的均值再鉴定的结果见表2,除S9外,尽管定性相似度SL差异不大,但是两个厂家的不同批次样品却能通过ML显著区别出差异(见图3)。10批样品除S9和S10质量为良好外,其余均为好或很好。S1～S6(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂)的质量等级均为2或3级,质量好,表明其工艺稳定;S7～S10(沈阳红药制药有限公司)质量等级4级以上,质量良好,表明制备工艺也较好。
系统指纹定量法[ 14 ](systematically quantified fingerprint method, SQFM)是由宏定性相似度Sm、宏定量相似度Pm和均化性变动系数 α 3个参数构成的中药质量评价标准。LQFM基于对照指纹向量与合格样品指纹向量各元素存在线性关系,对SQFM经过数学运算的参数优化而成,是为了避免测试样品由于来源差异造成定性相似度与定量相似度结果出现两极分化严重而使结果失真。SQFM评价三波长下RSGPW质量结果见表2。与LQFM评价结果相比,10批样品的定性相似度Sm(0～1)没有显著差异;造成不同批次样品质量差异的主要是定量相似度Pm或ML, S1～S6(北京同仁堂)的ML值(98.2% ～112.9% )和S7～S10(沈阳红药)的ML值(75.5% ～99.3% )比其Pm值(96.4% ～120.7% )和(68.9% ～96.7% )更趋中(100% ),可见LQFM能避免由于样品来源参差不齐而引起含量比例差异增大,但仍能明显区别不同厂家产品质量差异,以及同一厂家质量控制的稳定程度。LQFM的结果得到SQFM评价结果的验证,表明LQFM在节省大量昂贵对照品的前提下有望推广到中药材、饮片、中药提取物、生产中间体及最终成品制剂的生产过程质量控制。
本文建立了LQFM理论模型,并根据RSGPW化学组分紫外吸收特征建立三波长HPLC指纹谱,利用LQFM评价了10批RSGPWs的质量。结果除S3、S8和S9外,三波长下各批样品与对照指纹谱相似度很高(SL≥0.91);除S3外,S1～S6(北京同仁堂)线性定量相似度ML均大于100% ,而S7～S10(沈阳红药)均小于100% ,较好地区分了不同厂家RSGPW的质量差异。方中有效成分皂苷类组分如人参皂苷、远志皂苷等有末端吸收,有机酸如阿魏酸等(200～250 nm, 270～350 nm)、内酯类组分如木香内酯、白术内酯等(210～250 nm)、黄酮类组分(210～250 nm, 270～360 nm)的最大紫外波长均不同。选取3个特征波长建立指纹谱能避免单一波长下化学信息的缺失,使评价结果更真实。LQFM理论模型与SQFM相比,运用于中药质量评价较系统指纹定量法更严格且十分有助于提升中药整体定量质量标准和规范中药质量控制。线性指纹定量法作为评价中药及其制剂的线性模型,可作为中药制备工艺、投料控制及过程质量的重要监控手段,特别是用易于获得的r和b为简化指标的线性指纹定量法有望最先在生产实践及科研中得到广泛推广应用,是中药指纹整体定量技术的一次巨大简化提升。
2013, Vol. 31 Issue (5): 456-461
PDF (487KB)
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