色谱  2013, Vol. 31 Issue (5): 416-422   PDF (872KB)    
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马会娟
马强
李文涛
孟宪双
李晶瑞
白桦
焦阳
张晓丽
化妆品中8种呋喃香豆素的高效液相色谱法检测及质谱确证
马会娟1, 马强1 , 李文涛1, 孟宪双1, 李晶瑞1, 白桦1, 焦阳2, 张晓丽2    
1. 中国检验检疫科学研究院, 北京 100123;
2. 国家质量监督检验检疫总局 国际检验检疫标准与技术法规研究中心, 北京 100028
收稿日期：2012-12-03
基金项目：质检公益性行业科研专项项目(2012104013-4);国家科技支撑计划项目(2013BAK04B03);国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2011IK196);国家标准化管理委员会计划项目(20101088-T-607).
通讯作者：马强,Tel:(010)85773279,E-mail:maqiang1129@yahoo.com.cn.
摘要：建立了同时测定化妆品中8种呋喃香豆素类化合物(8-羟基补骨脂素、补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、三甲沙林、欧前胡素和异欧前胡素)的高效液相色谱分析方法及液相色谱-串联质谱确证方法。膏霜类、水剂类、香波类、散粉类、唇膏类等不同类型的化妆品样品分别经适宜的提取溶液进行超声提取,提取液以离心处理后,取上清液经微孔滤膜过滤后测定。采用Agilent Zorbax SB-Phenyl色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)分离,以甲醇-乙腈-水三元流动相梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长250 nm。8-羟基补骨脂素的定量限为0.25 mg/kg,补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、三甲沙林、欧前胡素、异欧前胡素的定量限为0.5 mg/kg。在低、中、高3种加标水平下,8种待测组分的平均回收率为85.0%～105.8%,相对标准偏差为0.41%～7.90%。采用本方法在一日内不同时间点(6个时间点,每隔1 h测定一次)和不同日期(6 d内)测定混合标准溶液,得到8个目标物峰面积的日内精密度均小于1%,日间精密度均小于2%。该方法准确、简便、快速,适用于不同类型化妆品中8种呋喃香豆素类化合物的测定。
关键词： 高效液相色谱     液相色谱-质谱/质谱     呋喃香豆素     化妆品    
Simultaneous determination of eight furocoumarines in cosmetics by high performance liquid chromatography and verification by liquid chromatography-tandem mass spectrometry
MA Huijuan1, MA Qiang1 , LI Wentao1, MENG Xianshuang1, LI Jingrui1, BAI Hua1, JIAO Yang2, ZHANG Xiaoli2    
1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China;
2. Research Center for International Inspection and Quarantine Standard and Technical Regulation, General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine, Beijing 100028, China
Received: 2012-12-03
Abstract: A method using high performance liquid chromatography (HPLC) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed for the simultaneous determination of eight furocoumarines (8-hydroxypsoralen, psoralen, isopsoralen, 8-methoxypsoralen, 5-methoxypsoralen, trioxsalen, imperatorin and isoimperatorin) in cosmetics. The cosmetic samples, including cream, lotion, shampoo, powder and lipstick, were supersonically extracted with appropriate solvents. The extract was centrifuged, and the supernatant was filtered through a membrane, and then separated on an Agilent Zorbax SB-Phenyl chromatographic column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) by gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min with methanol-acetonitrile-water as mobile phases. The column temperature was set at 30 ℃. The wavelength of detection was 250 nm. The limits of quantification (LOQs) were 0.25 mg/kg for 8-hydroxypsoralen and 0.5 mg/kg for psoralen, isopsoralen, 8-methoxypsoralen, 5-methoxypsoralen, trioxsalen, imperatorin and isoimperatorin. The recoveries at three spiked levels were in the range of 85.0%-105.8% with the relative standard deviations (RSDs) of 0.41%-7.90%. The intra-day precision (n=6) was less than 1%, and the inter-day precision (n=6) was less than 2% for the peak areas of the eight furocoumarines in a mixed standard solution. The method is accurate, simple, rapid and suitable for the determination of the eight furocoumarines in various cosmetic samples.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)     furocoumarines     cosmetics    

呋喃香豆素(furocoumarines)是指母核的7位羟基与6位或者8位取代异戊烯基缩合形成呋喃环的一系列化合物,其属于香豆素类化合物,具有芳香气味,常被用来作为香料[ 1, 2, 3, 4 ]。研究人员已从芸香科柑橘属植物精油中分离出多种香豆素类化合物,其中大部分是呋喃香豆素[ 4, 5 ]。这些物质的存在使该类精油具有一定的光敏毒性,轻则引起皮肤黄褐斑或色素沉着,重则引起皮肤损伤,甚至可能导致皮肤癌,对人体健康构成重大的潜在危害。我国化妆品卫生规范、欧盟化妆品法规(Cosmetics Regulation EC 1223/2009)、东盟化妆品指令(ASEAN Cosmetic Directive)均规定呋喃香豆素为化妆品组分中禁用物质(天然香料中存在的正常含量除外),在防晒和晒黑产品中,呋喃香豆素的含量应小于1 mg/kg。

化妆品中香豆素的检测方法主要包括气相色谱-氢火焰离子化检测器法[ 6, 7 ]、气相色谱-质谱法[ 8, 9 ]、高效液相色谱-紫外/二极管阵列检测器法[ 10, 11, 12, 13 ]、液相色谱-质谱法[ 14, 15, 16 ]等,而目前关于化妆品中8-甲氧基补骨脂素等8种呋喃香豆素的同时测定则鲜有报道。本研究建立了同时测定化妆品中8种呋喃香豆素的高效液相色谱分析方法及质谱确证方法,能够为化妆品中呋喃香豆素的监测工作和产品质量控制提供科学依据和技术支持。



1 实验部分
1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪,配在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(美国Agilent公司); Xevo TQ三重四极杆质谱仪(美国Waters公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司); KQ-600B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); CR 21G型高速冷冻离心机(日本Hitachi公司);补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、三甲沙林、欧前胡素(美国Sigma公司), 8-羟基补骨脂素(美国ChromaDex公司),异欧前胡素(中国药品生物制品检定所);乙腈、甲醇、无水乙醇(色谱纯,美国Fisher公司);其他试剂均为分析纯。

1.2 液相色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax SB-Phenyl柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)。流动相:水(A)、甲醇(B)和乙腈(C)。梯度洗脱程序:0～12.5 min, 22%B、23%C; 12.5～14 min, 22%B～31%B、23%C～32%C; 14～21 min, 31%B～32%B、32%C; 21～22 min, 32%B～50%B、32%C～50%C; 22～25 min, 50%B～22%B、50%C～23%C。 流速:1.0 mL/min;进样量:10 μ L;检测波长:250 nm;柱温:30 ℃。

1.3 液相色谱-质谱确证条件

色谱柱:XBridge C18柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μ m)。流动相:水(A)和乙腈(B)。梯度洗脱程序: 0～6.5 min, 30%B; 6.5～10 min, 30%B～100%B; 10～12 min, 100%B; 12～13 min, 100%B～30%B; 13～15 min, 30%B。 流速:0.3 mL/min;进样量:10 μ L;柱温:30 ℃。

电喷雾离子源(ESI);毛细管电压:3.0 kV;萃取锥孔电压:1.0 V;射频透镜电压:0.0 V;离子源温度:150 ℃;去溶剂气为氮气,温度350 ℃,流量500 L/h;锥孔气为氮气,流量50 L/h;碰撞气为氩气,碰撞气压力0.32 Pa;多反应监测(MRM)模式检测,8种呋喃香豆素的质谱分析参数见表1。

表 1 8种呋喃香豆素的质谱分析参数 Table 1 LC-MS/MS parameters for the eight furocoumarines
1.4 标准溶液的配制

准确称取8种呋喃香豆素标准物质各10 mg(精确至0.1 mg),分别置于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,摇匀,配制成质量浓度分别为 1000 mg/L 的标准储备液。将标准储备溶液配制成混合标准储备溶液后再将其稀释成质量浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5 mg/L 的系列混合标准溶液。

1.5 样品处理
1.5.1 膏霜类样品的处理

称取1 g(精确至0.001 g)试样于50 mL具塞锥形瓶中,加入10 mL 50%(v/v,下同)乙醇水溶液,旋涡混合后超声提取30 min。取部分溶液转移至10 mL具塞塑料离心管中,以 5000 r/min 离心10 min,上清液经0.45 μ m微孔滤膜,供高效液相色谱测定。

1.5.2 水剂类样品的处理

称取1 g(精确至0.001 g)试样置于50 mL具塞锥形瓶中,加入10 mL无水乙醇,其余步骤同1.5.1节。

1.5.3 香波类样品的处理

称取1 g(精确至0.001 g)试样置于50 mL具塞锥形瓶中,加入10 mL 50%甲醇水溶液,其余步骤同1.5.1节。

1.5.4 散粉类样品的处理

称取1 g(精确至0.001 g)试样置于50 mL具塞锥形瓶中,加入10 mL 50%乙腈水溶液,其余步骤同1.5.1节。

1.5.5 唇膏类样品的处理

称取1 g(精确至0.001 g)试样置于50 mL具塞锥形瓶中,加入2 mL四氢呋喃,旋涡混合后加入8 mL 50%乙醇水溶液,其余步骤同1.5.1节。

2 结果与讨论
2.1 前处理条件的优化
2.1.1 提取溶剂的选择

呋喃香豆素化合物在乙腈、甲醇等有机溶剂中均有较好的溶解度,本实验考察了甲醇、无水乙醇、乙腈、50%甲醇水溶液、50%乙醇水溶液、50%乙腈水溶液等提取溶剂对于膏霜类、水剂类、香波类、散粉类和唇膏类化妆品样品中呋喃香豆素的提取效果,超声提取时间均为30 min。经过比较发现,不同类型的化妆品达到最高提取效率时所对应的提取溶剂的类别不尽相同(见图1),膏霜类、水剂类、香波类、散粉类和唇膏类化妆品的最佳提取溶剂分别为50%乙醇水溶液、无水乙醇、50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液和50%乙醇水溶液。其中,由于唇膏类化妆品中含有较多的油脂、蜡类等成分,因此加入四氢呋喃可以有效地溶解样品基质,从而有利于样品的提取。

图 1 不同类型化妆品提取溶液的选择 Fig. 1 Selection of extraction solvent for different cosmetics Extractants: 1. methanol; 2. ethanol; 3. acetonitrile; 4. 50% methanol aqueous solution; 5. 50% ethanol aqueous solution; 6. 50% acetonitrile aqueous solution.
2.1.2 提取时间的选择

在2.1.1节得出的实验条件下,在化妆品空白样品中定量添加8种呋喃香豆素成分,分别超声提取10、20、30、40、50 min。结果表明,随着提取时间的增加,提取率先增加,但当提取时间超过30 min后,提取率略微下降(见图2),因此确定最佳超声提取时间为30 min。

图 2 提取时间的选择 Fig. 2 Selection of extraction time
2.2 色谱条件的优化
2.2.1 色谱柱的选择

分别考察了Waters Atlantis T3(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)、Waters XTerra MS C18(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)、Waters Symmetry C8(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)、Agilent ZORBAX SB-Phenyl(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)等不同类型色谱柱的分离效果。结果表明,8种呋喃香豆素在不同固定相及不同品牌的色谱柱上表现出一定的分离选择性差异。综合考虑色谱峰分离度和分析时间,最终选择采用Agilent Zorbax SB-Phenyl色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)。

2.2.2 流动相的选择

在液相色谱分析中,流动相的组成将影响目标化合物的色谱峰形、分离度等。本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水和甲醇-乙腈-水3种流动相体系对呋喃香豆素的液相色谱分离效果。结果表明,甲醇-乙腈-水三相混合流动相体系获得的色谱峰形和分离度最佳;进一步对流动相的梯度洗脱程序进行了详细优化,确定了1.2节的梯度洗脱条件。

2.2.3 检测波长的选择

分别对8种呋喃香豆素标准溶液进行190 ～ 800 nm范围的紫外-可见光全波长扫描分析,考虑低波长可能造成较大的基线漂移,影响定量的准确性,综合考虑各呋喃香豆素化合物的紫外-可见光谱特性,确定采用250 nm作为检测波长。

2.2.4 柱温的选择

柱温对呋喃香豆素化合物的色谱保留及分离选择性具有一定的影响,本研究考察了柱温在20 ～ 40 ℃下的分离情况。结果表明,当柱温为30 ℃时,各化合物的色谱峰之间实现了理想的分离。

在优化条件下8种呋喃香豆素混合标准溶液的液相色谱分离图见图3。

图 3 8种呋喃香豆素混合标准溶液的色谱图 Fig. 3 Chromatogram of a mixture of the eight furocoumarines 1. 8-hydroxypsoralen; 2. psoralen; 3. isopsoralen; 4. 8-methoxypsoralen; 5. 5-methoxypsoralen; 6. trioxsalen; 7. imperatorin; 8. isoimperatorin.
2.3 方法的线性关系和定量限

将混合标准储备溶液逐级稀释得到质量浓度依次为0.025、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5 mg/L 的混合标准工作溶液,按1.2节的测定条件对混合标准工 作溶液由低浓度到高浓度依次进样分析,以各呋喃 香豆素的峰面积(Y)对相应的质量浓度(X)绘制标准曲线,得到线性回归方程。8种呋喃香豆素的保留时间、线性回归方程、线性范围、相关系数及定量限(以S/N=10估算)见表2。

表 2 8种呋喃香豆素的保留时间、线性回归方程、线性范围、相关系数及定量限 Table 2 Retention times, regression equations, linear ranges, correlation coefficients (r) and limits of quantification (LOQs) for the eight furocoumarines
2.4 方法的回收率和精密度

以不含有呋喃香豆素的膏霜类、水剂类、香波类、散粉类、唇膏类等不同类型的化妆品样品为基质,分别进行添加回收率和精密度的测定。在低、中、高3个加标水平下,每个水平平行测定6次,8种呋喃香豆素化合物的平均回收率为85.0% ～105.8% ,相对标准偏差为0.41% ～7.90% ,结果见表3。

采用本方法在一日内不同时间点(6个时间点，每隔1 h测定一次)和不同日期(6 d内)测定混合标准溶液，得到8个目标物峰面积的日内精密度均小于1% ,日间精密度均小于2% 。

表 3 不同类型空白化妆品中8种呋喃香豆素的加标回收率和精密度(n=6) Table 3 Recoveries and their precisions of the eight furocoumarins spiked in five forms of samples (n=6)
2.5 液相色谱-质谱确证

阳性样品需用液相色谱-质谱进行确认。按照1.3节下条件进行测定,如果试样中呋喃香豆素化合物的色谱峰的保留时间与标准工作溶液相符(变化范围在±2.5%之内),样品中呋喃香豆素化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致,相对丰度偏差不超过表1的规定,则可判断样品中存在呋喃香豆素。图4为8种呋喃香豆素的MRM谱图。

图 4 8种呋喃香豆素的MRM谱图 Fig. 4 MRM chromatograms of the eight furocoumarines 1. 8-hydroxypsoralen; 2. psoralen; 3. isopsoralen; 4. 8-methoxypsoralen; 5. 5-methoxypsoralen; 6. trioxsalen; 7. imperatorin; 8. isoimperatorin.
2.6 样品测定

应用本方法分别对膏霜类、水剂类、香波类、散粉类和唇膏类等不同类型的化妆品样品共20件进行测定,均未检出含有呋喃香豆素类化合物。

3 结论

本文建立了膏霜类、水剂类、香波类、散粉类、唇膏类等不同类型化妆品中8种呋喃香豆素化合物的高效液相色谱检测方法及液相色谱-质谱确证方法。该方法具有操作简便、回收率高、精密度好和灵敏度高等特点,为不同种类化妆品中呋喃香豆素类化合物的检验鉴定和质量控制提供了实用有效的技术方法。

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