Waters 2695型高效液相色谱仪,配Waters 2475型荧光检测器(美国Waters公司); Biofuge Primo高速离心机(德国Kendro公司); MSI Minishake旋涡混合器(德国IKA公司); ME215S电子天平(德国Sartorius公司); Milli-Q纯水机(美国Millipore公司)。

阿曲库铵苯磺酸盐对照品(纯度98.2% ,江苏恒瑞医药股份有限公司);劳丹碱对照品(纯度99% ,美国Sigma公司);注射用苯磺酸阿曲库铵、注射用顺苯磺酸阿曲库铵(江苏恒瑞医药股份有限公司);盐酸维拉帕米注射剂(内标,上海禾丰制药有限公司);二氯甲烷、甲醇、乙腈(色谱纯,美国Tedia公司); K₂HPO₄、NaOH、NaH₂PO₄、H₃PO₄均为国产分析纯;实验用水为去离子纯化水。

阿曲库铵标准储备液:精密称取阿曲库铵苯磺酸盐对照品10 mg,置于10 mL容量瓶中,以0.1 mmol/L 盐酸溶液溶解并稀释至刻度,得1.0 g/L 的标准储备液,于4 ℃下保存备用。

劳丹碱标准储备液:精密称取劳丹碱对照品10 mg,置于10 mL容量瓶中,以0.1 mmol/L 盐酸溶液溶解并稀释至刻度,得1.0 g/L 的标准储备液,于4 ℃下保存备用。

内标溶液:精密量取维拉帕米注射剂适量,用水稀释至10 mg/L 作内标溶液,于4 ℃下保存备用。

色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μ m);柱温:25 ℃;流动相:0.03 mol/L 磷酸氢二钾(用磷酸调pH值至5.0)-乙腈(72 ∶ 28, v/v),以0.45 μ m微孔滤膜过滤;流速:1.0 mL/min;荧光检测波长:激发波长( λ _Ex)为240 nm,发射波长( λ _Em)为320 nm;进样量:20 μ L。

取肝素抗凝的狗全血2 mL,采血管中提前加入2 mol/L 硫酸40 μ L(使血浆的pH值约为4.0),防止药物降解,于 3500 r/min 下离心10 min后,取血浆约1 mL,于-20 ℃下保存备用。

取上述血浆样品0.2 mL于离心管中,加入内标溶液50 μ L,混匀,然后加1 mol/L NaH₂PO₄ (pH 5.5) 0.5 mL,混匀后加1 mL二氯甲烷,混旋萃取5 min,于 3500 r/min 下离心5 min,取下层有机相于另一离心管中,室温下用氮气流吹干;残渣用200 μ L流动相溶解,取20 μ L进样测定。

在相同的条件下,将样品色谱图与阿曲库铵和劳丹碱标准溶液的色谱图对照,根据保留时间确定样品中各组分的色谱峰;由于注射用阿曲库铵中反-反异构体和顺-反异构体含量较低,且3种异构体的含量比例一定,故测定时以顺-顺阿曲库铵的峰面积计算。在标准溶液与样品进样量相同的情况下,应用内标法定量,计算样品中各物质的含量。

由于阿曲库铵在生理温度及pH值条件下稳定性较差,进入生物体后很快会发生霍夫曼消除,降解为劳丹碱,故采血管内必须提前加入硫酸,使血样呈酸性,防止采血后阿曲库铵继续降解。文献报道的样品制备方法有固相萃取^{[ 3, 7 ]}、蛋白质沉淀^{[ 4, 10 ]}、液-液萃取^{[ 6, 9 ]}等方法,但固相萃取法操作复杂而且成本较高,故本研究考察了蛋白质沉淀、液-液萃取两种提取方法。研究发现蛋白质沉淀方法虽操作简单,但该方法需将样品稀释,阿曲库铵的检出限勉强可以满足实验要求,但劳丹碱的检出限却无法满足需要。本文采用液-液萃取法,考察了不同有机溶剂、溶剂体积以及提取时间对待测物提取效率的影响,最后选用提取效率高的二氯甲烷为提取溶剂,并浓缩提取液。该提取方法成本低、操作简便且灵敏度高,可以满足样品测定需求。

肌肉松弛药属弱碱性胺类,通常以盐形式存在,在萃取过程中缓冲液的pH值对药物的提取回收率有较大的影响。文献^{[ 5, 6, 7 ]}采用pH为5.0、5.4、6.0的缓冲试剂。本文考察比较了pH值为4.5、5.0、5.5、6.0的缓冲液对待测物回收率的影响,结果显示pH为5.5时阿曲库铵的提取效率最高,故选用pH 5.5的NaH₂PO₄溶液(1 mol/L)为提取缓冲液。

以流动相为空白调零,取1.0 g/L 阿曲库铵标准溶液进样,采用手动停流技术,在荧光检测器上通过对阿曲库铵的激发光谱(200～450 nm)和发射光谱(250～650 nm)扫描,分别得到最大激发波长240 nm和最大发射波长320 nm。

文献^{[ 11 ]}报道测定顺阿曲库铵时流动相采用0.05 mol/L 磷酸二氢钾(pH 3.0)-乙腈(50 ∶ 50, v/v),由于顺阿曲库铵中不含其他异构体,色谱峰较易分离,故分析时间较短。但是在上述条件下无法达到阿曲库铵中3种异构体的分离,故对流动相的比例及缓冲盐的pH值进行优化,最终选用1.4节中的色谱条件,各峰峰形和分离情况均较好,且不受内源性杂质的干扰。图1为空白血浆、空白血浆中添加对照品以及含药血浆样品的HPLC-FLD谱图,由此可见,血浆中内源性物质不干扰阿曲库铵及劳丹碱的测定。劳丹碱、顺-顺阿曲库铵和维拉帕米的保留时间分别为2.8、12.7和21.2 min。

图1

Fig. 1

图 1 (a)空白血浆、(b)空白血浆添加对照品和(c)含药血浆样品的HPLC-FLD谱图 Fig. 1 Chromatograms of (a) a blank plasma sample,(b) a blank plasma sample spiked with standards and (c) a plasma sample with the drugs Peaks: 1. laudanosine; 2. trans-trans atracurium; 3. cis-trans atracurium; 4. cis-cis atracurium; 5. verapamil.

取空白狗血浆0.2 mL,分别加内标液50 μ L,加1 mol/L NaH₂PO₄(pH 5.5) 0.5 mL,加入阿曲库铵和劳丹碱的标准储备液配制成含阿曲库铵25、50、100、250、1000、2500、5000μg/L 以及含劳丹碱25、50、100、500、1500、3000、6000μg/L 的含药血浆,按1.5节中血浆样品处理方法处理后进样,分别测得阿曲库铵、劳丹碱和内标的峰面积。以待测物的质量浓度(x, μ g/L)为横坐标,分别以顺-顺阿曲库铵对内标的峰面积比(y)、劳丹碱对内标的峰面积比(y)为纵坐标进行线性回归,得到阿曲库铵血药浓度的回归方程为y=0.0023x-0.0768,线性范围为25～5000μg/L, r=0.9990;劳丹碱的回归方程为y=0.0023x+0.0022,线性范围为25～6000μg/L, r=0.9984。以信噪比为3计阿曲库铵和劳丹碱的检出限分别为3μg/L 和1μg/L。

取空白狗血浆0.2 mL,分别配制低、中、高3个质量浓度的质控(QC)样品,使阿曲库铵含量分别为50、250、2500 μ g/L 以及劳丹碱含量分别为50、500、3000 μ g/L；QC样品每一浓度水平配制6份,按1.5节样品处理方法操作,以当日的标准曲线计算样品的浓度得日内精密度;连续测定5 d,每日测定1次,得到日间精密度。对QC样品进行测定后,各组样品峰面积与内标峰面积之比代入当日标准曲线回归方程计算质量浓度,与加入浓度比较得方法的回收率,用以表示分析的准确度,结果见表1。由表1可见,日内、日间精密度良好,方法的回收率在92.1% ～109.5%之间。

表 1 空白狗血浆中阿曲库铵和劳丹碱的加标回收率和精密度 Table 1 Recoveries and precisions (RSD) of atracurium and laudanosine spiked in a blank dog plasma sample Analyte Spiked/( μ g/L) Recovery/% RSD/% Intra-day(n=6) Inter-day(n=5) Atracurium 50 92.1 8.8 9.7 250 109.5 7.2 8.5 2500 103.8 5.2 7.8 Laudanosine 50 98.5 7.2 9.9 500 101.7 8.0 9.6 3000 92.8 6.2 8.9

表 1 空白狗血浆中阿曲库铵和劳丹碱的加标回收率和精密度 Table 1 Recoveries and precisions (RSD) of atracurium and laudanosine spiked in a blank dog plasma sample

配制含阿曲库铵低、中、高3个浓度的QC样品,每个浓度水平平行配制3份样品,分别考察各浓度样品在-20 ℃冰箱中保存14 d、室温下放置7 h、反复冻融3次及按1.5节处理后室温下放置12 h后阿曲库铵的稳定性。结果表明,样品中阿曲库铵在上述条件下稳定性良好, 各组的RSD均小于10% ,方法的回收率在87.8% ～111.5%之间(见表2)。

表 2 不同条件下狗血浆中阿曲库铵的稳定性(n=3) Table 2 Stability of atracurium spiked in dog plasma stored under various conditions (n=3) Condition Spiked/ ( μ g/L) Found/ ( μ g/L) Recovery/ % RSD/ % Ⅰ 50 52.3 104.6 4.69 250 269.5 107.8 3.57 2500 2594 103.8 4.41 Ⅱ 50 55.7 111.4 4.23 250 273.4 109.4 5.54 2500 2667 106.7 3.23 Ⅲ 50 43.9 87.8 6.95 250 238.5 95.4 2.71 2500 2752 110.1 8.99 Ⅳ 50 52.6 105.2 8.23 250 263.5 105.4 4.13 2500 2787 111.5 9.59 Conditions: Ⅰ. The dog plasma spiked with atracurium standard was stored at -20 ℃ for 14 days.Ⅱ. The dog plasma spiked with atracurium standard was stored at room temperature for 7 h. Ⅲ. The dog plasma spiked with atracurium was processed, then stored for 12 h at room temperature. Ⅳ. The dog plasma spiked with atracurium standard was frozen-thawed for 3 cycles.

表 2 不同条件下狗血浆中阿曲库铵的稳定性(n=3) Table 2 Stability of atracurium spiked in dog plasma stored under various conditions (n=3)

健康狼狗5只,雌雄不分,体重17～23 kg,以2.5%戊巴比妥钠基础麻醉,气管插管后进行体外循环,注射用苯磺酸阿曲库铵以0.8 mg/kg 剂量股静脉注射。分别在给药前和给药后1、3、5、7、10、15、30、45、60、90、120和150 min时股动脉取血约2 mL(采血管中提前加入2 mol/L 硫酸40 μ L,防止药物降解),于 3500 r/min 下离心5 min后取血浆约1 mL,按照1.5节操作测定血药浓度,测得阿曲库铵和劳丹碱的平均血药浓度-时间曲线(见图2)。通过血药浓度-时间曲线的数学模型分析,可以得到阿曲库铵和劳丹碱的药动学参数,通过与非体外循环条件下药动学参数的比较,可以制定出适合体外循环下麻醉手术的个体化给药方案,以指导临床合理用药;通过劳丹碱的血药浓度监测可以降低手术中患者突发惊厥的可能性,为临床安全用药提供参考。

图2

Fig. 2

图 2 体外循环下狗血浆中阿曲库铵和劳丹碱的平均血药浓度-时间曲线 Fig. 2 Mean concentration-time curves of atracurium and laudanosine in dog plasma during cardiopulmonary bypass

由于缺乏顺苯磺酸阿曲库铵对照品,故采用注射用顺苯磺酸阿曲库铵进行初步考察。取空白狗血浆0.2 mL,加入内标液50 μ L、1 mol/L NaH₂PO₄(pH 5.5) 0.5 mL、顺苯磺酸阿曲库铵溶液和劳丹碱标准液适量,配制成顺阿曲库铵约250 μ g/L 及劳丹碱约100 μ g/L 的含药血浆,按1.5节中血浆样品处理方法处理后进样分析。在优化的色谱条件下,顺苯磺酸阿曲库铵与内标均可得到良好的分离,内源性物质对其测定没有干扰(见图3)。由此可见本方法也可用于顺苯磺酸阿曲库铵的血浆样品分析。由于样品成分减少,分析顺苯磺酸阿曲库铵时可适当调整流动相比例,使出峰时间提前,以节省分析时间,提高工作效率。

图3

Fig. 3

图 3 添加顺阿曲库铵及劳丹碱的空白血浆的色谱图 Fig. 3 Chromatogram of a blank plasma sample spiked with cis-atracurium and laudanosine Peaks: 1. laudanosine; 2. cis-cis atracurium; 3. verapamil.