Waters高效液相色谱仪(1525泵,2707自动进样器,1500柱温箱,2475荧光检测器,Breeze2色谱工作站)。对照品芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚均购自中国食品药品检定研究院,甲醇为色谱纯,实验用水为超纯水,其余试剂为分析纯。大黄蒽醌提取物为自制。

清洁级SD大鼠,体重180～200 g,由复旦大学实验动物科学部提供,合格证号:SCXK(沪)2009-0019,实验前适应1周,大黄蒽醌提取物适量口服灌胃给药。

根据文献^{[ 1, 5 ]},采用Luna C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m,美国菲罗门公司),流动相由0.1% (v/v)磷酸水溶液和甲醇组成,等度洗脱,荧光检测激发波长为440 nm,发射波长为540 nm;根据实验设计,磷酸溶液pH值为1.78～2.66,甲醇在流动相中的体积分数为78% ～84% ,流速0.8～1.2 mL/min,柱温25～35 ℃,进样体积10～30 μ L。

混合对照品溶液:分别精密称取5种大黄蒽醌对照品适量至25 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,置4 ℃冰箱中保存,作为贮备液。临用前分别吸取各贮备液适量置于同一100 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即为大黄蒽醌衍生物的混合对照品溶液。

混合对照品血浆溶液:向大鼠血浆样品(200 μ L)中精密加入混合对照品溶液适量,漩涡混匀,即得。

血浆样品的预处理:根据文献^{[ 3 ]},以3倍体积的甲醇沉淀血浆蛋白,漩涡混匀,以 10000 r/min 离心5 min,取上清液转移至1.5 mL PE管(聚乙烯管)中,在恒温水浴(40 ℃)氮气吹干。残渣加入50 μ L流动相,超声溶解,以 5000 r/min 离心3 min,取上清液作为供试品溶液。

在预实验基础上,考察5个色谱因素对4个色谱响应值的影响。5个因素包括流动相中甲醇的体积分数、流速、柱温、磷酸溶液pH值、进样体积,4个响应值为最先洗脱色谱峰(芦荟大黄素)和相邻杂质间的分离度(R₁)和理论塔板数(n₁)、最末洗脱峰(大黄素甲醚)的保留时间(t_R5)以及大黄酸的拖尾因子(T₂)。各因素及水平如表1所示。

表 1 Plackett-Burman实验设计的色谱因素、水平及响应值 Table 1 Chromatographic factors and response variables for Plackett-Burman experimental design Chromatographic factor Levels Low High Volume ratio of methanol/% 78 84 Flow rate/(mL/min) 0.8 1.2 Column temperature/ ℃ 25 35 pH 1.78 2.66 Injection volume/ μ L 10 30

表 1 Plackett-Burman实验设计的色谱因素、水平及响应值 Table 1 Chromatographic factors and response variables for Plackett-Burman experimental design

保持以下色谱条件不变:进样体积20 μ L,激发波长440 nm,发射波长540 nm, 0.1%(v/v)磷酸pH值为2.20。选取流动相中甲醇含量、流速和柱温,分别记为A、B、C,进行Box-Behnken实验,考察A、B、C三因素对响应值R₁、n₁和t_R5的影响。各因素取3水平,分别记为-、0、+,设计参数见表2。

表 2 Box-Behnken优化实验设计的参数 Table 2 Optimization parameters for Box-Behnken experimental design Run Pattern (ABC) A/% B/(mL/min) C/ ℃ 1 - - 0 78 0.8 30 2 0 - + 81 0.8 35 3 0 0 0 81 1 30 4 - 0 + 78 1 35 5 + 0 + 84 1 35 6 0 - - 81 0.8 25 7 - + 0 78 1.2 30 8 0 + - 81 1.2 25 9 - 0 - 78 1 25 10 + + 0 84 1.2 30 11 0 0 0 81 1 30 12 + - 0 84 0.8 30 13 + 0 - 84 1 25 14 0 0 0 81 1 30 15 0 + + 81 1.2 35 A: volume ratio of methanol; B: flow rate; C: column temperature.

表 2 Box-Behnken优化实验设计的参数 Table 2 Optimization parameters for Box-Behnken experimental design

系统适用性是验证一个HPLC系统正常运行、结果可靠的重要标准^{[ 10 ]}。此外,溶剂用量、分析时间以及色谱柱使用寿命等也是分析工作者关注的事项^{[ 11 ]}。分析工作者须对此作出综合评价和取舍。 色谱柱类型、流动相组成等因素及其交互作用决定了这些指标的优劣。系统适用性等硬性指标必须符合要求,而溶剂消耗等指标又可以根据个人习惯灵活掌握,这充分符合QbD理念。

传统的建立高效液相色谱分析的方法多采用单因素法^{[ 12, 13 ]},其缺点是试验次数多,且不能考察因素之间的交互作用。肖文军等^{[ 14 ]}采用正交设计确定HPLC方法,该方法可以考察因素间的相互作用,但正交设计是建立在因素和响应值呈线性关系的基础上,当二者呈非线性关系时,预测性会受到影响。

响应面法(response surface methodology, RSM)是近年来常用的集数学和统计学方法于一体的优化方法,该方法常结合实验设计来测定最优值^{[ 15 ]}。最常用的实验设计为中心组合设计(central composite design, CCD)^{[ 8 ]}和Box-Behnken设计(BBD)^{[ 9 ]},这些方法不仅可以考察因素间的交互作用,而且适合探索二次方程的响应面及二次多项式模型。其中BBD实验次数较少,因此更为简便。同时,由于影响色谱系统的因素较多,因此有必要在响应面分析之前筛选出具有显著效应的因素。Plackett-Burman设计(PBD)被广泛地用于因素-主效应的估计,PBD可以利用最少的实验次数,快速而有效地筛选出对结果影响显著的因素^{[ 9 ]}。因此,本研究采用PBD筛选主要因素,并联用BBD优化HPLC方法。

本研究中流动相的磷酸溶液pH值在1.78～2.66之间,普通HPLC色谱柱的pH适用范围在2～8之间,因此考察了可在pH 2以下使用的几种色谱柱,结合分离度、保留时间等指标,最终选用Luna C18色谱柱(250 mm×4. 6 mm, 5 μ m,美国菲罗门公司,pH稳定性1.5～10)。

本研究涉及的各条件下,5种大黄蒽醌的出峰顺序依次为:芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚,依次记为1～5,结构式见图1。随着流动相中甲醇体积分数的增大,化合物3的保留时间会迅速减小；当甲醇体积分数升高到85%时,化合物2和3的色谱峰出现部分重叠,其原因可能是由于化合物3含有3个羟基,当甲醇体积分数提高时,其与甲醇形成氢键的可能性也提高,从而加快了洗脱速率。以化合物3和2的分离度R₃＞1.5为标准,确定甲醇体积分数的最高水平为84% ；又以化合物5的出峰时间＜30 min为标准,确定甲醇体积分数的最低水平为78% 。

图1

Fig. 1

图 1 5种测定物质的结构式 Fig. 1 Chemical structures of the five investigated compounds

根据文献^{[ 1 ]},确定流动相中磷酸溶液的体积分数为0.1% ,测得pH约为2.20,因此分别取pH 1.78和2.66作为实验设计的“低”和“高”水平。

色谱系统的适用性试验通常包括理论塔板数、分离度、拖尾因子和重复性等4个参数^{[ 16 ]},本研究选取前三者作为响应值。此外,分析时间也是分析工作者经常考虑的因素,缩短分析时间,可以节约溶剂和提高工作效率,因此选取最末洗脱峰的保留时间t_R5作为第4个考察指标。

对于同时测定多个组分的色谱分析而言,考察每个组分对应的各响应值不仅工作量大,而且也没有必要。参考“木桶理论(Cannikin Law)^{[ 17 ]}”并结合预实验,本研究选取每一类指标中“最弱”的一项进行考察,当该项指标符合要求时,则同类指标均能符合标准。本研究中,化合物1的理论塔板数n₁最低,因此选取n₁以考察理论塔板数;大鼠血浆中的极性成分会影响最先洗脱的化合物1的分离,而其他相邻组分在本文所述条件下分离度均大于1.5,因此选取化合物1和相邻杂质的分离度R₁考察分离度;同理选取化合物2考察拖尾因子(T₂)。

结果显示,具有显著意义(p＜0.05)的色谱因素包括流动相中甲醇体积分数、流速和柱温。各因素对拖尾因子T₂均无显著性影响(p＞0.05),因此在接下来的实验中不再考察拖尾因子;流动相中甲醇体积分数对其他3个响应值的影响最为显著。

选择R₁、n₁及t_R5为响应值,对A、B和C 3个因素进行优化,建立因素和响应值关系的二次方程: Y= β ₀+ β ₁A+ β ₂B+ β ₃C+ β ₁₂AB+ β ₁₃AC+ β ₂₃BC+ β ₁₁A²+ β ₂₂B²+ β ₃₃C²,其中Y为响应值, β i代表不同的回归系数。应用统计分析软件Design Expert 7.0对数据进行多元回归和方差分析,结果如表3所示,可见因素A对R₁、n₁和t_R5均具有显著影响;因素B对t_R5、因素C对R₁也有显著影响。为简化方程求解,在保证拟合度的前提下,进行了相应的方程简化,在p＜0.1水平上拒绝无显著相关的项目后,诸响应值与实验因素的拟合方程列于表4。

表 3 Box-Behnken设计的方差分析结果 Table 3 Analysis of variance (ANOVA) results for Box-Behnken design Factor R1 n1 tR5 F p F p F p A 659.74 ＜0.0001* 15.75 0.0016* 77.14 ＜0.0001* B 0.91 0.3850 1.10 0.3429 40.64 ＜0.0001* C 39.73 0.0015* 3.79 0.1091 2.52 0.1408 AB 0.004 0.9511 0.075 0.7950 AC 3.05 0.1414 0.74 0.4302 BC 2.64 0.1649 0.23 0.6518 A2 13.05 0.0153* 17.87 0.0083* B2 0.24 0.6467 4.88 0.0783 C2 0.75 0.4272 6.94 0.0463* * p-value is less than a priori value of 0.05 and is statistically significant.

表 3 Box-Behnken设计的方差分析结果 Table 3 Analysis of variance (ANOVA) results for Box-Behnken design

建立响应面和等高线图(图2)以直观分析各因素及其相互作用对响应值的影响。等高线图中曲线的弯曲程度反映模型的非线性程度。结果显示,当柱温恒定时,流动相中甲醇体积分数增大,R₁呈近似线性的下降,而流速对R₁影响不明显;t_R5随甲醇体积分数和流速的增大呈线性下降;结合表4,各因素对n₁的影响呈二次多项式模式,而因素间的交互作用对其影响不显著(p＞0.05)。

图2

Fig. 2

图 2 各考察因素对响应值影响的响应面(3D)和等高线图 Fig. 2 Response surfaces (3D) and contour plots showing the effects of examined factors on responses

表 4 Box-Behnken设计的响应模型和统计参数 Table 4 Response models and statistical parameters obtained from ANOVA for Box-Behnken design Response Regression model Model p-value R2adj R1 -56.31+1.48A+1.06B+0.24C-0.003AC-0.04BC-0.01A2 ＜0.0001 0.9857 n1 -369069+8912.72A+12663.63B+780.73C-55.67A2-6542.66B2-12.49C2 0.0021 0.8002 tR5 139.97-1.34A-14.56B ＜0.0001 0.8799

表 4 Box-Behnken设计的响应模型和统计参数 Table 4 Response models and statistical parameters obtained from ANOVA for Box-Behnken design

用Derringer渴求函数(desirability function)评价各响应值的综合作用,其公式如下:

其中,pi为响应值的权重,本文权重取1, n为响应值的数目,d_i为单个响应值的渴求函数。D值在0～1之间;D值越接近1则说明所确定的最优条件越接近全局最优条件。本研究设响应值目标为:n₁＞3000, R₁＞1.5, t_R5取最小值,利用Design-Expert 7.0软件整合渴求函数计算的功能,得最大化总体渴求值(D)为0.81,相对文献^{[ 1 ]}提高了19.1% 。因素的最佳水平组合为:流动相中甲醇体积分数为81.4% ,等度洗脱,流速为1.1 mL/min,柱温为31 ℃。取供试品溶液按照最优条件重复进样6次,考察实测值与预测值的偏差,结果显示偏差不超过5% ,表明模型具有良好的预测性。

在优化的色谱条件下,考察了方法的系统适用性。各色谱峰均能得到有效分离,见图3。大鼠经大黄提取物给药后,血浆中能测到化合物1～4,其中化合物2浓度最高,而化合物5的浓度低于检出限(LOD),与文献^{[ 3 ]}报道一致。首先出峰的化合物1与杂质峰的分离度不小于1.5;理论塔板数按化合物1计不低于 3000。同一供试品溶液重复进样6次,5种化合物峰面积的日内精密度(RSD)不超过2.1% 。制备各被测物质的标准曲线,其线性方程、相关系数(r)、LOD(S/N=3)及线性范围见表5。

图3

Fig. 3

图 3 (a) 5种大黄蒽醌混合对照品溶液、(b)大鼠空白血浆溶液、(c)大鼠空白血浆加对照品溶液及(d)大鼠经大黄提取物给药后血浆溶液的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of (a) the mixed standards, (b) a blank plasma, (c) a plasma sample spiked with the mixed standards, and (d) a plasma sample after administration of rhubarb extract 1. aloe-emodin； 2. rhein； 3. emodin； 4. chrysophanol； 5. physcion.

表 5 血浆样品中5种测定物质的标准曲线、相关系数、线性范围及检出限(n=5) Table 5 Linear equations, correlation coefficients (r), linear ranges, and limits of detection (LODs) of the five analytes in plasma sample (n=5) Analyte Linear equation r Linear range/(mg/L) LOD/( μ g/L) Aloe-emodin Y=0.3958X+0.1065 0.9990 0.11-21.00 5.00 Rhein Y=0.4015X+0.0512 0.9992 0.08-15.00 4.50 Emodin Y=0.3769X+0.1805 0.9991 0.08-16.00 10.00 Chrysophanol Y=0.4530X - 0.0059 0.9985 0.15-30.00 10.00 Physcion Y=0.3203X+0.2106 0.9990 0.10-20.00 5.00 Y: peak area; X: mass concentration, mg/L.

表 5 血浆样品中5种测定物质的标准曲线、相关系数、线性范围及检出限(n=5) Table 5 Linear equations, correlation coefficients (r), linear ranges, and limits of detection (LODs) of the five analytes in plasma sample (n=5)