色谱  2013, Vol. 31 Issue (6): 582-586   PDF (384KB)    
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石冬琴
王荣
谢华
田薇
贾正平
郭建魁
结直肠癌组织中K-ras基因突变的毛细管电泳检测
石冬琴1,2, 王荣1,2 , 谢华1, 田薇2, 贾正平1 , 郭建魁1    
1. 全军高原损伤防治重点实验室, 兰州军区兰州总医院临床药理基地, 甘肃 兰州 730050;
2. 浙江农林大学林业与生物技术学院, 浙江 临安 311300
收稿日期：2012-12-12
基金项目：国家自然科学基金项目(20775089);全军医药卫生"十一五"科研课题(06MB096).
通讯作者：王荣, 贾正平.E-mail:wangrong-69@163.com;jiazzp166@sina.com.
摘要：通过对PCR扩增的76例结直肠癌组织及癌旁正常组织DNA基因组共152个样本纯化变性后,采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)结合单链构象多态性(SSCP)分析方法检测了人结直肠癌组织及癌旁正常组织中K-ras基因第12/13位密码子突变。所检测的76例结直肠癌患者中有30例患者存在基因突变,并对异常片段进行测序验证,测序证实以碱基G→A点突变为主。结果表明所建立的CE-LIF技术结合SSCP分析检测K-ras基因突变的方法高效、快速、灵敏、准确,适合于临床上大样本结直肠癌中K-ras基因突变分析,对选择抗结直肠癌药物有一定的指导作用。
关键词： 毛细管电泳     K-ras基因     单链构象多态性     基因突变     结直肠癌组织    
Determination of K-ras gene mutation in colorectal cancer tissue by capillary electrophoresis
SHI Dongqin1,2, WANG Rong1,2 , XIE Hua1, TIAN Wei2, JIA Zhengping1 , GUO Jiankui1    
1. PLA Key Laboratory of the Plateau of the Environmental Damage Control, Base of Clinic Pharmacology, Lanzhou General Hospital, Lanzhou 730050, China;
2. Forest and Biotechnology College, Zhejiang Agriculture and Forest University, Lin’an 311300, China
Received: 2012-12-12
Abstract: The codons 12/13 of K-ras genomic DNA from 76 colorectal cancer tissues and normal tissues were amplified by PCR. The amplified 152 samples were purified, denatured, and then detected using capillary electrophoresis (CE)-laser induced fluorescence (LIF) with single-strand conformation polymorphism (SSCP). The abnormal samples were further confirmed by direct-sequencing. The 30 patients of the 76 colorectal cancer patients were found gene mutation, of which the results of base G→A point mutation were confirmed by the gene sequence. To detect K-ras gene mutation that has important role in clinical forecast, diagnosis, therapy and prognosis, the CE-LIF with SSCP was applied for detecting K-ras gene. It becomes a promising tool to analyse K-ras gene mutation in the clinical diagnosis and therapy of colorectal cancer tissue.
Key words: capillary electrophoresis (CE)     K-ras gene     single-strand conformation polymorphism     gene mutation     colorectal cancer tissue    

K-ras基因是ras基因家族中3种癌基因的一种,为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)信号传导通路的下游基因,与结直肠癌关系密切[ 1 ]。我国大肠癌发病率已占到常见肿瘤的第四位,且发病率已达5% ,高于2%的国际水平;每年新发病例约40万,其中30～40岁的中年人居多。各个国家和地区的结直肠癌中K-ras基因突变率并不相同,欧美为30% ～68%[ 2, 3 ],而中国为14% ～43.8%[ 4, 5 ]。K-ras基因最常见的激活方式是点突变,其中90%发生在第一外显子的第12、13位密码子上,其中70%发生于第12位密码子,30%发生于第13位密码子[ 6 ];极少文献报道第19、61、63位密码子发生突变。第12、13位密码子常用的检测方法主要有DNA测序[ 7 ]。根据结直肠癌患者中K-ras基因是野生型还是突变型,将传统意义上的一种疾病分成两种独立的疾病进行治疗。结直肠癌患者中K-ras基因为突变型的约占40% ,而其余60%左右的K-ras基因为野生型,目前临床治疗中抗EGFR靶向药物对K-ras野生型大肠癌患者疗效显著,而对突变型无效,如不加区分采取同一种药物治疗将会增加不良反应风险和治疗费用。因此,对K-ras突变类型的检测[ 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ],可以筛选出抗EGFR靶向药物治疗有效的大肠癌患者,实现肿瘤病人的个体化治疗,从而达到良好的预后,延长患者生存期。临床统计分析发现,大肠原发病灶的患者手术后5年复发转移率较高,即病情分期越晚者复发转移的风险越高。早期检测K-ras基因，可早期治疗，从而有效降低病人复发转移的风险。因此,检测K-ras基因第12/13位密码子的突变情况,对于结直肠癌的临床早期诊断、治疗和预后有重要意义。

本实验采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)结合单链构象多态性(SSCP)技术,采用作者所在课题组已建立的CE-SSCP方法检测了临床结直肠癌手术标本和经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE，formalin-fixed and paraffin-embedded)同一组织标本中K-ras基因第12/13位密码子突变,并应用DNA直接测序法进行验证,其结果可为结直肠癌的临床诊断和治疗提供科学理论依据。



1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

P/ACE System5000型毛细管电泳仪、P/ACE System5000 station数据处理软件、P/ACE System laser module 488 nm激光检测器(美国Beckman公司);石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂); DYY-8C型电泳仪、DYCZ-24E型电泳槽(北京市六一仪器厂); AE240型电子天平(瑞士Mettler公司);高速离心机(德国Heraeus公司); PCR扩增仪(杭州晶格科学仪器有限公司)。

聚环氧乙烷(PEO, Mr=300000)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、丙烯酰胺(国药集团化学试剂有限公司), γ -甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)(Johson Matthey公司),三羟甲基氨基甲烷(Tris,上海山浦化工有限公司),硼酸、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(天津化学试剂厂), SanPrep柱式PCR产物回收试剂盒SK8142、Taq DNA聚合酶、PCR试剂、DNA Marker-B GM331、6×Loading Dye Solution SD8314、pUC19 DNA/Msp I (Hpa II)Marker(上海生工生物工程技术服务有限公司), Golden View核酸染料、核酸染料SYBR GreenⅠ(10000×, 50 μ L/支;厦门百维信公司),以上试剂均为分析纯。

0.5×Tris-硼酸(TBE)缓冲液成分:0.045 mol/L Tris-硼酸+0.001 mol/L EDTA; 1×Tris-乙酸(TAE)缓冲液成分:0.04 mol/L Tris-乙酸+0.001 mol/L EDTA。

样品测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

结直肠癌及癌旁正常组织样本(包括临床手术后组织和经FFPE处理的同一组织)共76例152个样本,其中男53例,女23例,年龄20～84岁,平均年龄(65±2)岁。所有标本取自兰州军区兰州总医院病理科,结直肠部切除组织并经病理切片证实,其中高分化腺瘤6例,中分化腺瘤46例,低分化腺瘤13例,黏液腺瘤11例。

1.2 实验步骤
1.2.1 DNA提取

结直肠癌及癌旁正常组织的DNA提取:用扭力天平称取结直肠癌及癌旁正常组织40 mg,剪碎匀浆后加入蛋白酶-K消化,采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA。采用紫外分光光度计对提取的基因组DNA的纯度和浓度进行检测,在260、280 nm波长下的光密度D的比值(D260/D280)为1.7～1.9,符合DNA检测要求。于-20 ℃下保存待用。

FFPE组织标本的DNA提取:用电子天平称取石蜡切片20～25 mg,放入2 mL的无菌离心管中。首先对其进行脱蜡:加入1 mL的二甲苯充分摇匀,于 3000×g下离心2 min,弃去上清液;加入1 mL无水乙醇混匀,于 3000×g下离心2 min,弃去上清液,再重复脱蜡一次;然后依次用100% 、95%和75%的乙醇各1 mL洗至沉淀为松散的白色。脱蜡完全后的组织由原来的粉红透明状变为松散的白色沉淀状。然后对其进行消化:将脱蜡后的组织放入37 ℃温箱中15～ 30 min,待乙醇挥发干净后,加入200 μ L的STE溶液(100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 20 mmol/L EDTA, 8 g/L SDS),于90 ℃水浴锅中加热10 min后,加入20 g/L 蛋白酶-K,在55 ℃水浴中加热3 h以上直至絮状物消失。于 3000×g下离心1 min,取上清液,采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA, D260/D280值为1.7～1.9,于-20 ℃下保存待用。


1.2.2 K-ras基因的PCR扩增及纯化

所选引物为文献[ 14 ]中所述的K-ras基因第一外显子第12/13位密码子所需特异性引物,上游引物:5′-AGGCCTGCTGAAATGACTGAATA-3,下游引物:5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3。扩增产物长度约184 bp。PCR反应体系为25 μ L,其中含dNTP 200 μ mol/L、引物0.05 μ mol/L、Taq聚合酶5 U/ μ L、模板DNA 0.5 μ g。PCR反应循环条件:94 ℃变性30 s, 59.6 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s,共行30个循环。由于扩增过程中产生的引物二聚体以及dNTP、引物、镁离子等会影响分析结果,本实验采用SanPrep柱式PCR产物回收试剂盒纯化PCR扩增产物。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测

取纯化后PCR扩增产物5 μ L,加入1 μ L 6×蛋白上样染料溶液(Loading Dye Solution)进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为1×TAE缓冲液(pH 8.5),用Golden View核酸染料染色,并用凝胶成像分析系统照相和分析结果。

1.2.4 CE-SSCP检测

根据文献[ 15 ]的方法涂层毛细管柱(37 cm×75 μ m,有效长度27 cm)。取5 μ L PCR产物加入纯水20 μ L, 95 ℃变性15 min,立即在冰浴中放置5 min,于 3000×g下离心10 s。向25 μ L经变性处理的样品中加入5 μ L SYBR GreenⅠ并混合均匀,在10 kV电压下负极电动进样15 s,采用课题组已建立的以3% PEO为筛分介质分离pUC19 DNA/Msp I (Hpa II) Marker的最佳分离条件,对结直肠癌临床手术直接取用组织和FFPE组织标本中的K-ras基因的第12/13位密码子的突变情况进行检测。

1.2.5 DNA测序分析

用ABI-PRISM 3730测序仪测序验证经CE-SSCP检测的样品。

2 结果与讨论
2.1 pUC19 DNA/Msp I (Hpa II) Marker最佳分离条件

采用课题组已建立的CE分离pUC19 DNA/Msp I (Hpa II) Marker的最佳条件[ 15 ]:筛分介质PEO的含量为3% 、缓冲液TBE的pH 8.3、电压15 kV、温度15 ℃。CE分离结果如图1所示:共得到11个峰,基本达到基线分离,15 min内达到完全分离。表明建立的方法具有分离快速、分离度良好的优点。

图 1 毛细管电泳分离pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ) Marker Fig. 1 Electropherogram of pUC19 DNA/MspⅠ (Hpa Ⅱ) Marker separation by CE 1. 26 bp; 2. 34 bp; 3. 67 bp; 4. 110 bp, 111 bp; 5. 147 bp; 6. 190 bp; 7. 242 bp; 8. 331 bp; 9. 404 bp; 10. 489 bp; 11. 501 bp.
2.2 琼脂糖凝胶电泳结果

2%琼脂糖凝胶电泳分析纯化的扩增产物,结直肠癌组织及癌旁正常组织的电泳扩增结果见图2。如图2可见,扩增获得了纯度较高的目的产物。

图 2 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的谱图 Fig. 2 Electropherogram of PCR amplification by AGE M: GM331 DNA Marker B. 1, 2. normal tissue; 3, 4. colorectal cancer tissue.
2.3 CE-SSCP结果

SSCP分析的原理是基于单链DNA具有不同的构象,DNA链上单个碱基的变化会引起其构象的变化,构象不同则电泳淌度随之改变,通过电泳将构象上有差异的单链分离。临床手术所取样品按照1.2.4节的条件处理,获得变性样品,经CE-LIF检测分析,结果见图3。图3a为结直肠癌旁正常组织扩增变性样品,图3b为结直肠癌组织扩增变性样品。比较上述两图,发现结直肠癌组织中除有正常样品的野生型单链DNA外,还存在有异常单链DNA,即结直肠癌K-ras基因第12/13位密码子突变样本中除具有野生型DNA变性后会有的两个单链DNA外,还存在突变基因变性后的两条单链DNA。因此,可通过癌旁正常组织(图3a)的电泳谱图(作为野生型标准对照谱图)判读癌组织突变型(图3b)的K-ras基因第12/13位密码子的突变是否发生。

图 3 CE-SSCP检测变性(a)结直肠癌旁正常组织和(b)结直肠癌组织的DNA电泳图 Fig. 3 Electropherograms of degenerated DNA samples of (a) normal tissue and (b) colorectal cancer tissue by CE-SSCP 1, 2. denaturated single strand of normal tissue; 3, 4. denaturated mutant type single strand of colorectal cancer tissue.

FFPE组织标本和临床手术直接取用组织样品的检测结果一致。

通过CE-LIF检测各类组织样品,证实所建立的方法可有效地检测结直肠癌K-ras基因第12/13位密码子的突变。

2.4 测序结果

为进一步确认CE-LIF检测的样本发生突变的类型,对相应样本进行了测序分析。测序结果显示,K-ras基因突变为单个碱基点突变,即K-ras基因第12位密码子主要突变类型有GGT→GAT、GGT→GCT和GGT→CGT;第13位密码子主要突变为GGC→GAC,其中以碱基G替换为碱基A(G→A)的点突变为主。

2.5 临床样本K-ras基因突变结果

分别对76例患者临床手术切除组织获得的癌组织及癌旁组织共计152个样本进行K-ras突变基因第12、13位密码子检测,经CE-LIF检测和基因测序,表明CE-SSCP检测和基因测序结果一致,K-ras基因第12、13位密码子突变类型见表1。

表 1 76例患者中K-ras基因第12、13位密码子突变类型的CE-LIF检测和基因测序结果 Table 1 Results of codons 12 and 13 mutation type of K-ras in the 76 cases by CE-LIF and gene sequencing
3 结论

采用课题组已建立的方法[ 15 ]检测了76例结直肠癌患者组织中K-ras基因第12/13位密码子突变情况,结果显示30例发生突变,突变率为39.5%(30/76),该结果与文献报道中国的结果(14% ～43.8% )[ 4, 5 ]一致。结直肠癌患者中K-ras基因的高突变率,表明K-ras基因突变在结直肠癌的发生及发展中有重要作用。基因突变常以碱基的缺失、插入、替代为主,从而引起癌基因的激活与抑癌基因的失活。本研究通过直接测序证实,K-ras基因碱基发生点突变,以碱基G替换为碱基A为主要突变类型,其中第12位密码子GGT突变为GAT的突变率为28.9%(22/76),第13位密码子GGC突变为GAC的突变率为5.3%(4/76)。与以往文献报道的中国人K-ras基因突变以第12位密码子(GGT→GAT)多见[ 4 ]的结果一致。

尽管已有文献[ 16 ]报道采用CE方法对K-ras基因进行了检测,但本研究结果证实,作者所在课题组所建立的以3%PEO为筛分介质的CE-SSCP分析方法可以在11 min内分离pUC19 DNA/Msp I (Hpa II) Marker 11个DNA片段及4个单链DNA(ssDNA),较文献报道的以6%线性聚丙烯酰胺为筛分介质的CE方法分离时间短,且多次检测证实分析条件稳定。

近年来,靶向药物的出现为结直肠癌的治疗带来了希望,但治疗效果与K-ras基因突变与否有密切的关系,因此K-ras基因突变与抗结直肠癌治疗效果的相关性受到人们的重视,K-ras基因突变的检测在治疗及预后方面有重要意义。同时,K-ras基因突变的检测有助于实现肿瘤治疗的个体化,不仅可以提高药物疗效,减轻患者病痛,而且能够减少患者经济负担和医疗支出。此外,CE-SSCP法与直接基因测序法相比,具有操作简单、运行成本低、不需要设计检测探针的优点,可用于临床批量检测。

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