神经节苷脂(gangliosides, GLS)是生物体内一类重要的活性物质,与神经细胞的分化、突触的形成有重要关系。海参和海胆体内含有较丰富的GLS,结构与哺乳动物体内的GLS有明显不同,目前研究者已从海参和海胆中分离出数十种具有独特结构的GLS[ 1 ],其中单唾液酸神经节苷脂(monosialogangliosides, MG)含量较高。体外实验显示MG可显著抑制体外培养的大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)的增殖,并促进其轴突生长[ 2 ],开发海参和海胆MG作为新型药物或功能性食品具有良好的前景。海参和海胆中MG与常见哺乳动物的MG结构明显不同,其分子中仅有两个糖基,唾液酸(sialic acid, Sia)通过 α2-6键连接于葡萄糖脑苷脂上,即Sia α2-6Glc-Ceramide[ 3 ]。唾液酸是构成神经节苷脂的必要糖类,最常见的唾液酸是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc),棘皮动物GLS的唾液酸常发生硫酸酯化或糖基化。海参和海胆的MG可按照其唾液酸残基上是否有硫酸基取代分为硫酸酯化单唾液酸神经节苷脂(sulfated monosialoganglioside, SMG)和非硫酸酯化单唾液酸神经节苷脂(nonsulfated monosialoganglioside, NMG)两类。
GLS的定量最常用的技术是薄层色谱法(TLC),薄层板展开后通过显色剂显色进行光密度扫描,显色剂一般是由可与唾液酸特异反应的间苯二酚、硫代巴比妥酸等试剂配制而成。TLC对具有不同糖簇结构的GLS有一定的分离能力,也可以用来同时定量不同种类GLS的含量[ 4 ]。尽管TLC操作简单快捷,成本低廉,但是其易于受样本中杂质的影响,使测定结果误差较大,且不能给出GLS的结构信息[ 5 ]。近年来液相色谱-质谱联用技术得到很大发展,已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。相比TLC,液相色谱-质谱联用技术具有极高的灵敏度和选择性,用于样品分析及定量测定时不易受杂质干扰[ 6 ]。2006年,Sorensen[ 7 ]首先利用反相液相色谱-质谱联用技术对牛奶和婴儿配方奶粉中的二唾液酸二己糖神经节苷脂(GD3)和单唾液酸二己糖神经节苷脂(GM3)进行了定量测定。GLS在反相柱上的分离是基于其酰胺链的碳原子数目,因而易导致同系GLS被分离成多重峰,甚至与不同系的GLS峰相互混杂,增加解析的难度和工作量[ 8, 9 ]。鉴于以上弊端,研究者开始使用正相液相色谱-质谱联用技术分析神经节苷脂。Ikeda等[ 10 ]采用正相液相色谱-质谱联用方法,成功实现对小鼠脑中GLS的组成分析及定位分析。Fong等[ 11, 12 ]则通过正相液相色谱-质谱联用,定量测定鼠脑和奶制品中GLS的含量。本研究旨在建立利用正相液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)联用技术测定海参和海胆中MG含量的方法,为海参和海胆的营养评价及综合利用提供方法基础。
蝶参(Psychropotes longicauda)、美国肉参(Isostichopus badionotus)、美国红参(Parastichopus californicus)、花刺参(Stichopus variegatus (Sempen))、糙海参(Holothuria scabras)、猪婆参(Bohadschia marmorata)、仿刺参(Apostichopus japonicas)、墨西哥参(Holothuria mexicana)、南非花刺参(Stichopus variegatus)、冰岛刺参(Cusumaria frondosa)等的干制品及其内脏和海参花干制品均购自青岛市南山水产市场,置于干燥器内保存。
马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)由獐子岛集团股份有限公司提供,紫海胆(Anthocidaris crassispina)和黄海胆(Glyptocidaris crenularis)购自青岛市南山水产市场。鲜活海胆去壳去内脏,收集生殖腺,冻干后置于干燥器内保存。
氯仿、甲醇、乙酸为国产分析纯;乙腈,色谱纯,Merck公司;乙酸铵,色谱纯,美国Sigma公司。ENVI-8 C8 SPE柱(500 mg),美国Supelco公司。APS-2 NH2柱(150 mm×2.1 mm, 3 μ m),美国Thermo公司。
从马粪海胆中分离自制的HPG-A1(Neu5Gc α2-6Glc-t16 ∶ 0-C22 ∶ 1, Mr 1078.7)和HPG-B1(HSO3-8Neu5Gc α2-6Glc-t18 ∶ 0-C22 ∶ 1, Mr 1186.7)分别作为NMG和SMG定量的对照品。
固相萃取仪,美国Supelco公司;GL-20G-Ⅱ高速离心机,上海安亭科学仪器厂;氮吹仪,日本Taitec公司;1260型高效液相色谱,G6410B三重四极杆质谱仪,美国Agilent公司。
提取:样品中的脂质按照Svennerholm法的改良方法[ 13 ]进行提取。称取样品100 mg于50 mL具塞离心管中,加入4 mL水均质,然后依次加入10.8 mL甲醇和5.4 mL氯仿,涡旋振荡10 s后静置提取30 min,离心收集上层清液于另一50 mL离心管中,在残渣中继续加入2 mL水和4 mL氯仿-甲醇(1 ∶ 2, v/v)振荡提取,离心收集上清液,合并;再向收集的上清液中加入5.2 mL水,振荡混匀,再次离心收集上层溶液,向残余下层溶液中加入2 mL 0.01 mol/L KCl萃取,合并上层溶液;用50%(体积分数)甲醇定容至50 mL。
净化:C8固相萃取柱预先依次用3 mL甲醇和1 mL 50%(体积分数)甲醇活化。将前述提取得到的样品溶液慢慢加至SPE柱上,调整真空度使流速约为3 mL/min。上样结束后用3 mL 50%甲醇洗脱杂质,抽干数秒后,用3×2 mL甲醇洗脱样品,于37 ℃下氮气吹干。海参样品复溶于1 mL水中,海胆样品复溶于25 mL水中,用0.22 μ m膜过滤后进行分析。
参照Fong等[ 11 ]色谱方法,结合质谱仪特点作出适当调整。色谱柱:APS-2 NH2色谱柱;流速:0.5 mL/min;进样体积:海参样品进样10 μ L,海胆样品进样1 μ L;流动相:A,乙腈;B, 50 mmol/L 乙酸铵溶液(pH 5.6)/乙腈(50 ∶ 50, v/v);时间梯度0→4→16→20 min,浓度(体积分数)梯度为95%A→95%A→10%A→10%A,在第8 min时开始进质谱检测。
一级质谱条件 电喷雾离子化(ESI),负离子模式;质量扫描范围m/z 1000～1250;毛细管电压3.5 kV;喷雾气压275 kPa;干燥气(N2)流速11.0 L/min;干燥气温度350 ℃。
MRM条件 裂解电压:NMG, 190 V; SMG, 260 V。碰撞能: NMG, 50 eV; SMG, 36 eV。驻留时间:根据需扫描的离子数,在20～50 ms间进行调整。NMG和SMG母离子通过保留时间(tR)和一级质谱扫描确定;NMG定量子离子碎片:Neu5Gc m/z 306.1, Neu5Ac m/z 290.1, KDN m/z 249.1; SMG定量子离子碎片:HSO3-8Neu5Ac m/z 370.1, HSO3-8Neu5Gc m/z 386.1。
精确称取1 mg NMG和SMG对照品分别溶于超纯水中,并梯度稀释至100、10、1 mg/L 和0.1 mg/L。取10 mg/L 的NMG和SMG对照品溶液,按1.3.1节的色谱条件连续进样6次,考察各峰的峰面积,以检测仪器的精密度;分别在室温放置8, 12, 24 h后进行测定,以检测色谱方法的稳定性。使用0.1 mg/L 对照品,调整进样量最终使得对照品相应色谱峰的信噪比(S/N)分别达到3和10,以此时的进样量作为NMG和SMG的检出限和定量限。1 mg/L 对照品依次进样1、2、5 μ L, 10 mg/L 对照品依次进样1、2、4 μ L, 100 mg/L 样品依次进样0.8 μ L和1.6 μ L，使得进样量分别为1、2、5、10、20、40、80、160 ng,根据峰面积和进样量绘制标准曲线。
取同一批马粪海胆生殖腺样品,按1.2节下样品溶液制备方法,分别制备供试品6份,按1.3.1节下色谱条件进行测定,以检测该前处理方法的重复性。以水和马粪海胆生殖腺样品作为基质,分别向0.1 g的两种基质中加入90、180、270 μ g的NMG和125、250、375 μ g的SMG(马粪海胆生殖腺样品中相应物质含量的50% 、100% 、150% )对照品后,按1.2节中方法处理样品后,通过LC-MS/MS法测定其中NMG和SMG的含量,考察样品的回收率；每组做6个平行试验。
亲水性氨基色谱柱主要依据糖链结构差异将神经节苷脂分离开,NMG和SMG可完全分离,互不干扰,谱图清晰易辨(见图1)。
紫海胆NMG和SMG在该液相色谱条件下都可被分为3簇。产生此结果的主要原因是分子中唾液酸和脂肪酸链上的羟基数目不同,导致其极性产生差异。其中色谱峰1、2、3为NMG,色谱峰4、5、6为SMG。峰1(tR=11.9 min)所含唾液酸为Neu5Ac,脂肪酸链上无羟基;峰2(tR=12.2 min)所含唾液酸为Neu5Gc,脂肪酸链上无羟基;峰3(tR=12.5 min)所含唾液酸也是Neu5Gc,所含脂肪酸为 α -羟基脂肪酸;SMG三重峰产生原因与NMG相同。因氨基色谱柱具有一定的阴离子交换作用[ 14 ],流动相中需添加适量的乙酸铵以促进强极性的SMG被洗脱,使峰形对称。
通常海参和海胆的GLS神经酰胺部分具有异质性,尤其是脂肪酸的组成变化较大,使得同系GLS一般具有10种以上的相对分子质量。以紫海胆为例,图2所示为其NMG和SMG的一级质谱图。NMG和SMG都是由多种分子组成,分子之间一般相差一个亚甲基的相对分子质量单位(14)。因此,质谱定量NMG和SMG时需同时检测多种相对分子质量。为取得最佳定量效果,质谱操作条件需预先优化。与一级选择离子监测(SIM)模式相比,采用二级MRM模式可显著降低信噪比,能准确定量相对含量较低的成分,适合复杂基质中NMG和SMG的定量分析。我们通过调整碰撞能量,使得定量的唾液酸离子具有最大丰度,优化出1.3.2节中MRM条件。
按1.4节方法考察精密度,NMG和SMG峰面积的RSD分别小于4.3%和4.1% ,表明仪器精密度良好。稳定性考察结果显示,NMG和SMG峰面积的RSD分别小于4.6%和4.2% ,表明样品在24 h内是稳定的。方法的重复性考察结果显示,NMG和SMG峰面积的RSD分别小于5.2%和4.3% ,具有良好的重复性和可靠性。NMG和SMG的检出限(S/N=3)分别为0.07 ng和0.11 ng,定量限(S/N=10)分别为0.22 ng和0.29 ng,表明方法具有较高灵敏度。
将HPG-A1和HPG-B1依次进样1、2、5、10、20、40、80、160 ng,绘制进样量与峰面积的线性曲线。本实验所测海参和海胆的NMG和SMG糖链连接方式都与对照品一致,实验中可省略对因样品糖链结构不同而产生的离子化效率差异的校正。NMG线性方程为y1=70.964x1+64.299, SMG线性方程为y2=61.439x2+0.574;其中y1、y2为峰面积,x1、x2为相应进样量。结果表明,进样量为1～40 ng时,两种对照品都呈现出良好的线性关系。当继续增大进样量至80 ng时,HPG-A1仍呈良好的线性关系,但HPG-B1的线性相关系数显著降低。因此在实验中控制MG的进样量在40 ng以下。
按1.4节方法测定加标回收率,得出NMG和SMG的加标回收率见表1。两种GLS的回收率较好,满足定量要求。但NMG的回收率明显低于SMG且偏差较大,推测是由于其极性较低,在萃取时不易进入水层。加标量在50% ～150%区间内,对回收率无明显影响,表明前处理方法较稳定。
唾液酸位于糖链非还原端的NMG和SMG神经节苷脂在负离子模式下进行二级质谱裂解,易断裂唾液酸糖苷键而产生唾液酸碎片离子;在一定的碰撞能量下,唾液酸碎片离子为基峰离子。因此,在通过MRM模式分析神经节苷脂含量时,常选用唾液酸碎片离子作为定量子离子。含不同唾液酸的NMG和SMG在APS-2柱的洗脱顺序见表2。
3种海胆样品中都同时含有NMG和SMG,它们的唾液酸组成不尽相同:紫海胆的NMG既有Neu5Gc也含有Neu5Ac,其SMG分子的唾液酸以HSO3-8Neu5Ac为主,同时含有少量HSO3-8Neu5Gc;黄海胆的NMG中除Neu5Ac和Neu5Gc外还含有一种特殊唾液酸KDN,其在自然界中含量低,发现较晚,一般在幼儿神经系统中相对含量较高[ 15 ];黄海胆中含KDN的MG在自然界中较罕见,有待深入研究。马粪海胆的NMG唾液酸成分与紫海胆相似,比例略有不同,SMG中唾液酸以HSO3-8Neu5Gc为主。3种海胆样品中各种NMG和SMG含量见表2。
对海参样品的一级质谱扫描发现,所测10种海参样品中都不含SMG; NMG大多为单一色谱峰,保留时间tR为12.3 min,二级质谱确定唾液酸为Neu5Gc,几乎不含Neu5Ac。几种海参的NMG含量测定结果见表3。
在所测海参样品中,美国红参所含NMG含量最高,为(131.1±7.3) μ g/g,其次是墨西哥参和仿刺参。通过对冰岛刺参体壁、生殖腺和肠道等不同组织的测定,发现冰岛刺参的生殖组织中NMG的含量最高;冰岛刺参肠道中NMG含量与体壁相近,具有一定的利用价值。
对3种海胆和10种海参中NMG和SMG的定量检测结果表明,海胆样品中黄海胆的NMG含量最高,约为3.82 mg/g;紫海胆的SMG含量最高,约为4.37 mg/g。海胆中总的MG含量(4.30～6.40 mg/g)明显高于各海参样品(8～131 μ g/g)。
本文以从马粪海胆中纯化得到的HPG-A1和HPG-B1为对照品,质谱采用MRM模式,以唾液酸碎片离子为定量子离子,实现了对海参和海胆中单唾液酸神经节苷脂的定量分析。结果显示海胆样品中MG的含量明显高于海参样品且含有大量SMG,具有较高的开发价值。该方法的建立有利于综合评价海参和海胆的营养价值。
2013, Vol. 31 Issue (5): 399-403
PDF (922KB)
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