色谱  2013, Vol. 31 Issue (5): 467-472   PDF (430KB)    
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王同波
闫潇
兰孝征
顶空吸附萃取-气相色谱法分析小麦中部分风味物质
王同波, 闫潇, 兰孝征     
山东农业大学化学与材料科学学院, 山东 泰安 271018
收稿日期：2012-12-25
基金项目：国家自然科学基金项目(21273138);山东省自然科学基金项目(ZR2010BM035).
通讯作者：兰孝征,Tel:(0538)8247753,E-mail:lanxzh@sdau.edu.cn.
摘要：采用顶空吸附萃取法(headspace sorptive extraction, HSSE)建立了小麦中部分风味物质的分析方法。以硅橡胶为原料,采用溶胶-热空气硫化法,在模具中定型制得硅橡胶萃取棒。萃取棒的硅橡胶层体积约为87 μL,热稳定性好,耐热温度达到390 ℃。萃取棒吸附的风味物质经自制热解吸装置热脱附,被吹扫进入气相色谱仪进行分析。考察了萃取温度及时间、相比、热解吸条件对该方法萃取效率的影响。在优化条件下分析小麦粉标准样品,结果表明:方法的线性关系良好(r>0.9979),检出限为0.09～1.00 μg/kg,标准物质的平均添加回收率为95%～121%,相对标准偏差在2.2%～7.8%之间。对小麦粉实际样品进行分析,采用外标法得到了7种风味物质的绝对含量。该方法简便快捷,检出限低,适用于小麦中风味物质的快速定量分析。
关键词： 顶空吸附萃取     溶胶-热空气硫化法     硅橡胶萃取棒     气相色谱     风味物质     小麦    
Analysis of part of flavor compounds in wheat by headspace sorptive extraction-gas chromatography
WANG Tongbo, YAN Xiao, LAN Xiaozheng     
College of Chemistry and Material Science, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China
Received: 2012-12-25
Abstract: A method has been established for the analysis of flavor compounds in wheat by headspace sorptive extraction (HSSE). The sorptive extraction bar was composed of a silicon rubber coating and a capillary glass with an inner iron rod. The silicon rubber coating was condensed inside a stainless steel mold from the silicon precursors with a sol-hot air vulcanization method. The coating of the extraction bar has a volume of about 87 μL and is thermally stable until 390 ℃. The flavor compounds extracted by the bar were desorbed in a homemade thermal desorption unit (TDU) and introduced directly into a pre-column in a gas chromatograph for analysis. Experimental parameters for the extraction efficiency were optimized including extraction temperature and time, phase ratio and thermal desorption conditions. The standard wheat flour samples spiked with seven flavor compounds were analyzed under the optimized conditions, and showed good linear relationships (r>0.9979), limits of detection (LOD) of 0.09-1.00 μg/kg, good recoveries (95%-121%) and repeatabilities (relative standard deviations, RSD, 2.2%-7.8%). By external calibration method, the absolute contents of the seven flavor compounds in a real wheat sample were determined. The method is rapid, simple with low limits of detection, and is applicable for the rapid quantitative analysis of the flavor compounds in wheat.
Key words: headspace sorptive extraction     sol-hot air vulcanization method     silicon rubber extraction bar     gas chromatography (GC)     flavor compounds     wheat    

风味物质是评价食品营养价值及质量品质的重要指标,关于饮料[ 1 ]、蔬菜[ 2 ]、水果[ 3 ]、谷物[ 4 ]中此类物质的研究已有许多报道。小麦是我国主要的储备粮,其营养价值与储藏品质的评价受到越来越多的关注。Maeda等[ 5 ]用商品化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取棒采用顶空吸附萃取法对不同脱皮度的小麦粉挥发性物质进行了检测。张玉荣等[ 6 ]利用顶空固相微萃取(HS-SPME)法对小麦在不同储藏时间的挥发性物质进行了测定,燕雯等[ 7 ]用同样的方法分析了黄淮地区不同筋力冬小麦品种的香气成分,袁建等[ 8 ]也利用此法分析了不同储藏条件下小麦粉挥发性组分的变化。以上报道仅是对小麦风味物质定性及在气相色谱中相对含量的检测,据检索文献分析,小麦基质成分复杂,基体中绝对定量方法尚无报道。

小麦中固有香气以及内部脂质的氧化和水解,糖类的代谢,蛋白质、氨基酸的降解及微生物的活动等产生的挥发性物质,是小麦中风味物质的主要来源。小麦风味物质在基体中的绝对定量,一方面有利于固有香气持续时间的研究,为麦香味小麦产品的生产提供指导;另一方面有利于内部脂质等成分变化量的研究,进而有利于评价小麦的营养价值及反映储藏品质的变化。

已报道的风味物质取样技术包括溶剂萃取法(SE)、同时蒸馏萃取法(SDE)、吹扫捕集法(PT)、直接热解吸法(DTD)、超临界CO2萃取法(SFE-CO2)、固相微萃取法(SPME)等。SPME法与其他方法相比,无需有机溶剂、样品量少、操作简单,可在短时间内完成分析,适合挥发性与半挥发性化合物的检出[ 9 ]。其中,顶空固相微萃取法(HS-SPME)大大减小了干扰物质的影响,适用于风味物质定性及定量分析。

搅拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction, SBSE)技术是1999年比利时Sandra教授提出的,相比于SPME,固定相体积增大了100～500倍,大大提高了萃取效率。顶空吸附萃取(headspace sorptive extraction, HSSE)技术是SBSE方法的延伸及扩展,2000年Tienpont等[ 10 ]和Bicchi等[ 11 ]首先应用了HSSE,该技术将萃取棒静悬于样品上方,萃取完成后,通过热脱附进入GC或GC-MS进行分析。HSSE相比于HS-SPME回收率高,适合痕量分析。小麦风味物质含量较低,用HSSE技术更有利于检测分析。

由于SBSE的萃取相体积较大,制备技术显得尤为关键。刘文民等[ 12 ]采用溶胶-凝胶技术制备了聚二甲基硅氧烷(PDMS)固相吸附萃取棒,对水中多环芳烃(PAHs)、有机磷农药、正构烷烃等进行了检测;Yang等[ 13 ]将PDMS键合在玻璃微球上,萃取分析了水样中的PAHs;纪祥娟等[ 14 ]采用溶胶-凝胶-硫化法制备的搅拌棒厚度达到250 μ m,成功地用于环境中PAHs的检测分析;Cheng等[ 15 ]采用同样的技术,成功地制备了厚壁PDMS棒,对水中PAHs进行了萃取分析。

本实验在恒定温度下对小麦粉抽真空,制得了空白小麦粉,并配制标准样品。以硅橡胶为原料,采用溶胶-热空气硫化法,利用不锈钢模具定型,制作硅橡胶萃取棒,结合自制热解吸装置(thermal desorption unit, TDU),与气相色谱联用,绝对定量分析小麦中的部分风味物质。



1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

GC-14C色谱仪、GCMS-QP2010 Plus气相色谱-质谱仪(日本岛津公司);固相微萃取装置、50/30 μ m DVB/CAR/PDMS萃取头(美国Supelco公司); MVS-1漩涡振荡器(北京金紫光科技发展有限公司);循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司); SK-2166多功能食品加工机(上海赛康电器有限公司)。

二氯甲烷(分析纯,徐州试剂二厂);甲醇(色谱纯,天津百灵威试剂公司);甲基乙烯基硅橡胶(MVSR)、乙烯基封端硅橡胶(VTMVSR)(均为工业级,山东莱州鑫泰化工有限公司);甲基乙烯基硅树脂(MQ,山东大易化工有限公司);过氧化二异丙苯(DCP,分析纯,天津市巴斯夫化工有限公司);含氢硅油(PMHs)、 γ -环氧丙氧基丙基三甲基硅烷(硅烷偶联剂KH-560)(分析纯,湖北武大有机硅新材料有限公司);丙酮(分析纯,天津市百世化工有限公司);二甲基二氯硅烷(分析纯,北京庆胜达化工技术有限公司);正己烷(分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司); 2-辛酮(2-octanone, 98% )、正辛醇(octanol, 99.5% )、正壬醛(nonanal, 96% )、正壬醇(n-nonanol, 99.5% )、癸醛(decanal, 97% )、十三烷(tridecane, 99% )、十五烷(pentadecane, 99% )(阿拉丁试剂)。

小麦样品(临汶4号,产自泰安,2012年6月收获)、空白小麦粉、标准品储备液均在4～6 ℃冰箱中储存备用。

1.2 色谱条件

采用SE-54毛细管柱(30 m×0.53 mm×0.25 μ m),预柱3 m;起始温度40 ℃,以5 ℃/min 升温至180 ℃,再以10 ℃/min 升温至240 ℃;载气为氢气,流速为6 mL/min;氢火焰离子化检测器(FID),温度为280 ℃;进样口温度240 ℃;不分流进样。

1.3 目标分析物质的选择

据文献[ 5, 6, 7, 8 ]报道,小麦的风味物质主要有酮类、醇类、醛类、烃类等。参照燕雯等[ 7 ]的分析方法，本实验室得到了实验小麦样品风味组分的质谱图，考虑到实验室自制的热解吸装置与气相色谱仪联用系统对半挥发性物质有较好的分离分析效果，选取2-辛酮、正辛醇、正壬醛、正壬醇、癸醛、十三烷、十五烷为定量分析目标物。

1.4 顶空萃取瓶的硅烷化处理及标准溶液的配制

将顶空萃取瓶在铬酸洗液中浸泡24 h,取出后依次用蒸馏水、甲醇、丙酮清洗,自然晾干,然后放入5%(v/v)二甲基二氯硅烷的正己烷溶液中浸泡,过夜,将浸泡过夜的顶空萃取瓶用甲醇清洗3遍,再用甲醇浸泡2 h,将瓶取出,吹干,置于烘箱内160 ℃烘2 h,自然冷却后,放入干燥器内,备用。

分别准确量取上述7种标准品200 μ L,置于50 mL容量瓶中,用甲醇定容,作为一级储备液,置于冰箱中储存。取适当储备液,根据需要配制混合标准溶液。

1.5 空白小麦粉的制备

取100 g小麦籽粒,粉碎机粉碎过筛,直至全部通过100目筛。将全部过筛的小麦粉,混合均匀,然后放入250 mL单口烧瓶中,于60 ℃恒温抽真空20 h,脱去被测挥发性组分,制备空白小麦粉,放置到冰箱中密封储存。

1.6 小麦粉标准样品的配制及工作曲线的绘制

分别移取适量的7种标准物质,用甲醇稀释配制成混合标准溶液(7种标准品质量浓度在1.2～12.7 g/L 之间),并逐级稀释,分别取2 μ L不同浓度的混合标准液于2.000 g空白小麦粉中,漩涡振荡30 min,混合均匀,配制为目标物含量不同的小麦粉标准样品。在优化的萃取条件下,利用吸附棒萃取目标物含量不同的小麦粉标准样品,以色谱峰面积为纵坐标,对应的各有机物含量为横坐标作图,绘制标准工作曲线。

1.7 热解吸装置、硅橡胶萃取棒及顶空萃取

热解吸单元与萃取棒制作模具,在本实验室已有装置[ 13, 15 ]的基础上做了改进。热解吸装置与气相色谱仪联用的示意图如图1所示,萃取棒制作模具如图2所示。

图 1 自制热解吸系统与气相色谱仪联用的示意图 Fig. 1 Schematic diagram of homemade thermal desorption unit (TDU) coupled with gas chromatograph a, f. stainless steel tube; b. nut; c. pressure cap; d. desorption tube; e. quartz lining tube; 1. purge gas; 2. auxiliary purge gas; 3. thermal desorption tube; 4. temperature control apparatus; 5. extraction bar; 6. detector; 7. pre-column; 8. press-fit connector; 9. analytical column.
图 2 (a)硅橡胶萃取棒、(b)不锈钢模具与(c)不锈钢 固定法兰的实物图 Fig. 2 Photographs of (a) silicon rubber extraction bar, (b)stainless steel mold and (c) stainless steel flange

硅橡胶萃取棒的制作,在Cheng等[ 15 ]方法的基础上进行了改进。具体如下:取480 mg VTMVSR用二氯甲烷溶解稀释,依次加入120 mg MVSR、240 mg MQ、14 μ L PHMs,振荡溶解、混合,抽真空。将内封铁芯的玻璃管分别用1 mol/L 的NaOH溶液和0.1%(v/v)盐酸浸泡8 h,烘干,最后放入20%(v/v)的KH-560溶液中浸泡24 h,晾干备用。将除去二氯甲烷的溶胶填充到模具的凹槽内,玻璃管放置于溶胶的中心部位,用法兰固定模具,在160 ℃烘箱中热空气硫化90 min。硫化成型的硅橡胶棒用二氯甲烷回流12 h,以除去未反应的小分子和低聚态杂质。然后在氮气保护下进行程序升温老化:150 ℃保持3 h,然后以1 ℃/min 升至200 ℃,保持3 h,最后以1 ℃/min 升至260 ℃,保持3 h,完成老化。

取2 g小麦粉放于自制顶空萃取瓶中,萃取棒用气相色谱进样针不锈钢推杆固定到样品瓶的顶空部位,推杆用气相色谱进样隔垫固定在样品瓶聚丙烯瓶盖上,抽动推杆调整萃取棒的位置。样品瓶放置在60 ℃恒温水浴中萃取90 min后，取出萃取棒放入热解吸装置中,在240 ℃下解吸5 min。萃取的风味物质经脱附后，吹扫进入气相色谱进行分析。

2 结果与讨论
2.1 小麦粉基质考察及硅橡胶萃取棒的热稳定性

样品的前处理过程中,基质效应是一个重要的影响因素[ 16 ]。小麦的成分复杂,主要成分是碳水化合物、蛋白质、脂肪、纤维等,小麦基质关系到测定结果的准确性。在优化条件下萃取分析空白小麦粉,可知所测目标组分的色谱峰高均低于3倍的色谱噪声(噪声约0.15 mV),而小麦粉样品中各风味组分的色谱峰均大于10 mV,因此完全满足配制小麦粉标准样品的需要。

按1.7节方法制备的萃取棒,其硅橡胶层体积约为87 μ L,透明度好。涂层经热重分析,耐热温度达到390 ℃,显示了良好的热稳定性。新制的萃取棒放入图1的热解吸管中,热脱附后按照风味物质的分析流程进行评价,得到的色谱图与(不加萃取棒)空白色谱图相比,没有发现硅橡胶层有明显的分解现象,说明萃取棒具有实用性。

2.2 HSSE萃取及解吸条件的选择
2.2.1 萃取温度对萃取效率的影响

HSSE的提取与富集是一个动态平衡过程,萃取温度是影响萃取效率的一个重要因素。温度升高,扩散速率变大,蒸汽压增大,会缩短萃取时间;而温度的升高,也会导致物质在固相萃取层的分配系数下降,HSSE的吸附量减少。取各有机物含量在0.75～3.2 mg/kg 之间的2 g小麦粉,控制萃取时间为30 min,选择20、40、60、80、100 ℃为考察温度。从图3可以看出,起初组分的萃取效率随着温度升高而上升;但随着温度持续升高,较低沸点物质的萃取效率呈下降趋势,十三烷、十五烷因为沸点较高,则需要更高的温度以达到最大萃取效率。综合考虑,将60 ℃确定为萃取温度。

图 3 萃取温度对萃取效率的影响 Fig. 3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency 1. 2-octanone (0.82 mg/kg); 2. octanol (0.82 mg/kg); 3. nonanal (0.83 mg/kg); 4. n-nonanol (3.2 mg/kg); 5. decanal (1.6 mg/kg); 6. tridecane (0.75 mg/kg); 7. pentadecane (1.92 mg/kg).
2.2.2 萃取时间对萃取效率的影响

在60 ℃下,考察不同萃取时间(30、60、90、120 min)对HSSE萃取效率的影响。从图4可以看出,随着萃取时间的增加,萃取效率增加,但由于各物质沸点、极性存在差异,最佳萃取时间不同。低沸点组分与高沸点组分相比,所需最佳萃取时间短,原因可能是高沸点组分从样品向顶空扩散速度较慢,需要更长的时间接近萃取平衡。随着萃取时间的延长,较低沸点物质如2-辛酮萃取效率呈下降趋势,而高沸点的物质如十五烷略有提高,这是因为高沸点物质的分配系数相对较大,而低沸点的物质分配系数较小；同样也与物质的极性强弱有关,非极性与弱极性的物质能更好地在硅橡胶涂层上富集。综合考虑,选用90 min作为萃取时间。

图 4 萃取时间对萃取效率的影响 Fig. 4 Effect of extraction time on extraction efficiency Compound Nos. and their contents are the same as in Fig. 3.
2.2.3 相比的优化

在HSSE分析方法中,相比( β ,顶空体积/样品体积)是影响萃取效率的重要因素[ 17 ]。选用2.000、4.000、8.000 g样品,放置到20 mL顶空萃取瓶中( β 分别为4.75、1.88、0.44),考察相比对萃取效率的影响。从图5可以看出,起初随着样品量的增加,相比减小,萃取量增加,这是因为小的相比有利于组分从气态传递到涂层[ 18 ];但是随着相比的继续减小,萃取量变化不大。虽然较小的相比有利于组分从气态传递到涂层,提高萃取量,但是气相体积小,不利于萃取操作。由于2.000 g样品( β =4.75)可以满足萃取要求,考虑到保护萃取棒、节约样品,选择2.000 g样品量( β =4.75)为萃取条件。

图 5 相比对萃取效率的影响 Fig. 5 Effect of phase ratio on extraction efficiency Compound Nos. and their contents are the same as in Fig. 3.

2.2.4 热解吸条件的优化

萃取棒在解吸时,解吸时间过短,会导致解吸不充分,影响分析结果;解吸时间过长或者解吸次数过多,不但会影响涂层的使用寿命,而且浪费分析时间。实验在240 ℃选取3、5、7 min进行考察。从图6可知,解吸时间为5 min时,被分析组分即可解吸完全;延长解吸时间,色谱响应信号并不增加。因此,实验选用240 ℃,热脱附5 min为解吸条件。

图 6 热解吸时间对萃取效率的影响 Fig. 6 Effect of desorption time on extraction efficiency Compound Nos. and their contents are the same as in Fig. 3.
2.3 方法的线性关系和检出限

按1.6节绘制标准工作曲线,结果表明在所测 定的含量范围内7种风味物质有良好的线性关系(r =0.9979～0.9998),按信噪比为3确定检出限(LOD)为0.09～1.00 μ g/kg。具体结果见表1。

表 1 7种风味物质的线性范围、线性方程、相关系数和检出限 Table 1 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients and limits of detection (LODs) of the seven flavor compounds
2.4 回收率试验和样品的测定

取2.000 g新粉碎小麦粉(小麦籽粒从收获到萃取已置于冰箱储存5个月),于自制顶空萃取瓶中经HSSE-TDU-GC方法得到7种风味物质在小麦基体中的含量(测定结果见表2,谱图见图7)。将1.6节中混合标准溶液用甲醇稀释,得7种标准品质量浓度在0.012～0.127 g/L 之间的混合标准溶液,准确移取2 μ L加入到2.000 g小麦粉中,制得加标小麦粉,在最佳萃取条件下重复进行6次试验,不同风味物质的回收率在96% ～121%之间,其相对标准偏差(RSD)为2.2% ～7.8% ,重复性较好。

表 2 小麦粉中7种风味物质的含量、加标回收率及其RSD(n=6) Table 2 Contents, recoveries and RSDs of the seven flavor compounds in wheat flour (n=6)
图 7 HSSE-TDU-GC得到7种风味物质的色谱图 Fig. 7 Chromatograms of the seven flavor compounds by HSSE-TDU-GC a. a wheat flour sample; b. a standard wheat flour sample spiked with the seven flavor compounds (3.2, 6.65, 12.7, 2.2, 3.2, 1.2, 3.1 mg/kg in turn).

Peaks: 1. 2-octanone; 2. octanol; 3. nonanal; 4. n-nonanol; 5. decanal; 6. tridecane; 7. pentadecane.
3 结论

本实验采用溶胶-热空气硫化法,利用不锈钢模具定型,制备了硅橡胶萃取棒,结合自制热解吸装置,与气相色谱联用,进行了顶空吸附萃取,定量分析了小麦中的7种风味物质。该方法简便快捷,精密度好,准确度高,检出限低,适用于小麦中风味物质的快速定量检测。

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