液相输液泵Trisep^TM-2100 Solvent Delivery和Trisep^TM-2100 Micro Fluid Control微流控装置(Unimicro Technologies);Trisep-2003色谱工作站(Unimicro Technologies, 2.18版);毛细管色谱柱(EP-250-15-5-C18,苏州环球色谱有限公司);微流蒸发光散射检测器( μ ELSD, UM-6000,上海通微分析技术有限公司);高纯氮气(上海纵远化工有限公司);电子天平(FA1004, No.SHP0200161738,上海恒平科学仪器有限公司);超声清洗仪(HS20500D Benchtop Cleaners, 20 L，天津恒奥科技发展有限公司)。

银杏叶提取物(江苏邳州富通生物制品有限公司,批号 111018;广东韶关市冠翔生物制品有限公司,批号 20120510;四川成都伟晖生物科技有限公司,批号MUST-11081806;浙江宁波德沃生物科技有限公司,批号 20120428),银杏叶提取物分散片(江苏晨牌药业有限公司),槲皮素(BR,国药集团化学试剂有限公司),白果内酯和银杏内酯A、B、C(≥98% ,北京仪化通标科技有限公司),纯净水(杭州娃哈哈集团),甲醇(色谱纯,国药集团化学试剂有限公司)。

槲皮素对照样品溶液:精密称取25 mg槲皮素,用甲醇完全溶解后,转移至5 mL容量瓶中并定容至刻度,得到5 g/L 的槲皮素样品储存液,4 ℃避光保存,待用。

银杏叶提取物样品:称取300 mg银杏叶提取物,用甲醇-水(9 ∶ 1, v/v)溶液溶解、稀释至75 g/L,超声提取1 h,过0.22 μ m有机滤膜,4 ℃避光保存,待用。

中药制剂银杏叶提取物分散片样品:将银杏叶提取物分散片研碎成粉,精密称取并用甲醇-水(9 ∶ 1, v/v)溶液稀释至300 g/L,超声提取1 h,弃去下层沉淀不溶物,过0.22 μ m有机滤膜,4 ℃避光保存,待用。

用于评价cLC- μ ELSD的重现性的样品为75 g/L 银杏叶提取物,分别来源于广东韶关(批号 20120510)、四川成都(批号MUST-11081806)、浙江宁波(批号 20120428)。

采用双泵系统,待测样品经反相cLC柱(C18, 15 cm×250 μ m, 5 μ m)分离。泵流速:0.05 mL/min;载气:2.5 L/min;温度:120 ℃;蒸发管:10 cm;喷嘴内径:440 μ m;石英喷针:6.5 cm×50 μ m i.d.×360 μ m o.d.;喷针位置:平齐;进样量:1 μ L;分流比:50 ∶ 1;载气:2.5 L/min;温度:120 ℃。流动相A为0.05%(v/v,下同)三氟乙酸(TFA)溶液,B为含0.05% TFA的甲醇溶液;流速:0.05 mL/min。梯度洗脱条件为0～10 min，5%B～25%B；10～25 min，25%B～38%B；25～35 min，38%B；35～40 min，38%B～42%B；40～55 min，42%B～50%B。

构建适用于纳升至微升级流量的cLC- μ ELSD分离检测体系,并将其应用于中药分离分析领域。cLC- μ ELSD装置如图1所示,色谱柱出口连接两通阀,两通阀另一段连接石英毛细管,此毛细管直接穿过雾化器不锈钢套管作为喷雾毛细管(即喷针)。样品经色谱柱分离后由喷雾毛细管雾化,进入 μ ELSD漂移管蒸发,进入检测池后散射检测。

图1

Fig. 1

图 1 cLC- μ ELSD的装置示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the cLC- μ ELSD system

μ ELSD由雾化器、蒸发漂移管、光散射池、信号放大与记录系统组成^{[ 14 ]}。样品检测主要分为3个阶段:经雾化器喷嘴喷出的载气同轴包裹色谱柱流出液,喷雾形成均匀雾滴阶段;漂移管加热蒸发使得溶剂蒸发,溶质液滴变为极细雾状颗粒阶段;检测池中样品颗粒经激光散射,光电倍增管放大后光信号转变为电信号的光散射检测阶段。经检测器参数优化,雾化毛细管与雾化器喷嘴的相对位置采用平齐状态。采用8 mm内径的10 cm蒸发漂移管和33 mm内径的60 mm光散射池进行实验。

漂移管温度与载气流量是影响信号响应的重要因素^{[ 17 ]}。采用5 g/L 槲皮素甲醇溶液作为样品，经反相色谱柱洗脱,分别考察不同漂移管温度与载气流量对样品响应的影响。结果发现,漂移管温度过低时溶剂不能得到充分蒸发,因而产生较大噪声。由图2可以看出,随着漂移管温度由40 ℃升高至120 ℃,槲皮素的信噪比得到明显提高。图3给出了温度对槲皮素样品洗脱时间的影响。可能由于漂移管温度导致载气热膨胀,随着漂移管温度提高,检测到的样品出峰时间略微缩短。

图2

Fig. 2

图 2 温度对槲皮素信噪比及噪声的影 Fig. 2 Effects of evaporative temperature on the S/N and noise level of quercetin

图3

Fig. 3

图 3 温度对槲皮素样品洗脱时间的影响 Fig. 3 Effect of evaporative temperature on the elution time of quercetin

此外,载气流量过低会形成较大的样品胶粒,基线噪声偏大并形成分叉峰^{[ 17 ]}；载气流速加快,样品可充分雾化而得到检测。因此选用2.5 L/min 氮气,120 ℃蒸发温度进行中药银杏叶提取物及其制剂的分离分析。

为了考察上述cLC- μ ELSD系统对实际样品的分析能力,选用复杂样品中药银杏叶提取物为样品,采用C18毛细管色谱柱对其进行分离。

对梯度条件进行了优化,结果如图4所示。减缓有机相比例的变化,分离度得到增加(图4a～e);而有机相比例增加速度过缓,也会导致分离效果变差(图4e～f)。此外,在反相分离系统中有机相比例变低,洗脱时间也会延长。综合考虑分离效果与样品完全洗脱时间,选择图4e的梯度洗脱条件。

图4

Fig. 4

图 4 洗脱梯度对cLC- μ ELSD分离银杏叶提取物结果的影响 Fig. 4 Effect of gradient separating conditions on the separation of Ginkgo Biloba extract with cLC- μ ELSD a. 0-10 min, 5%B-30%B; 10-25 min, 30%B-50%B; 25-35 min, 50%B-75%B; 35-60 min, 75%B-85%B; 60-80 min, 85%B-100%B. b. 0-10 min, 5%B-25%B; 10-25 min, 25%B-40%B; 25-35 min, 40%B-50%B; 35-55 min, 50%B-95%B. c. 0-10 min, 5%B-25%B; 10-25 min, 25%B-35%B; 25-35 min, 35%B-40%B; 35-55 min, 40%B-75%B. d. 0-10 min, 5%B-28%B; 10-25 min, 28%B-38%B; 25-35 min, 38%B-40%B; 35-45 min, 40%B-50%B; 45-65 min, 50%B-75%B. e. 0-10 min, 5%B-25%B; 10-25 min, 25%B-38%B; 25-35 min, 38%B; 35-40 min, 38%B-42%B; 40-55 min, 42%B-50%B. f. 0-10 min, 5%B-25%B; 10-25 min, 25%B-30%B; 25-35 min, 30%B; 35-40 min, 30%B-40%B; 40-55 min, 40%B-50%B. Mobile phases: A.0.05%TFA-water; B. 0.05%TFA-methanol.

结果表明,本研究搭建的cLC- μ ELSD联用平台在最优梯度条件下对银杏叶提取物分离效果良好。鉴于蒸发光散射检测相对紫外等检测手段具有通用性优势,可检测出复杂中药中更多组分。由于实现了微型化蒸发检测器与毛细管分离系统cLC联用,该方法相比传统液相色谱法大大减小了样品、流动相与固定相的消耗,并且拓展了 μ ELSD在微分离分析方面的应用。

进一步选用银杏叶分散片为研究对象,对cLC- μ ELSD联用技术的应用广泛性进行了考察。

银杏叶分散片是由银杏叶提取物制成的一种能在水中迅速崩解并均匀分散的片剂,其主要活性成分为总黄酮醇苷与萜类内酯^{[ 18 ]},并含微晶纤维素、交联聚维酮、微粉硅胶等辅料^{[ 19 ]},具有抑制氧自由基产生、改善血液流变学、舒张冠状动脉、改善血液循环、降低心肌耗氧量等多种药理作用。银杏叶分散片中主要活性成分为总黄酮醇苷和萜类内酯,其中萜类内酯,如白果内酯及银杏内酯A、B、C(见图5)无紫外吸收的特征基团,因此难以应用最常用的紫外检测。

图5

Fig. 5

图 5 银杏叶中萜类内酯的结构式 Fig. 5 Structures of terpene lactones in Ginkgo biloba

将银杏叶提取物分散片用甲醇-水混合体系溶解分散,超声提取并去除下层沉淀物,取上层样品溶解液。采用优化的梯度条件,在cLC- μ ELSD平台上进行分离检测。如图6所示,银杏叶提取物分散片在优化后的梯度条件下具有良好的分离效果。

图6

Fig. 6

图 6 cLC- μ ELSD分析银杏叶提取物分散片 及对其中4种萜类内酯的鉴 Fig. 6 Analysis of Ginkgo biloba extract disperse tablet and identification of four terpene lactones on cLC- μ ELSD

同时,与相同条件下萜类内酯标准品的分析结果进行比对,发现银杏叶提取物分散片中的确含有萜类内酯,说明本方法可非常方便地鉴定出这4种在银杏制剂中具有重要药理活性作用的萜类组分。

重现性是评价分析方法或仪器实用性的重要参数。采用优化的梯度条件,以3个不同地区厂家提供的银杏叶提取物为分析对象,分别对萜类内酯峰进行重现性的考察。由表1可知,各分析物的洗脱时间RSD均不大于2.42% ,证明该cLC- μ ELSD平台的重现性良好。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表 1 不同厂家银杏叶提取物中萜类内酯的保留时间 与相对标准偏差 Table 1 Retention times and RSDs of terpene lactones in Ginkgo biloba extract from different manufacturers Component t/min RSD/% BB 17.27 2.42 GC 21.74 1.26 GA 27.90 1.85 GB 29.07 1.92

表 1 不同厂家银杏叶提取物中萜类内酯的保留时间 与相对标准偏差 Table 1 Retention times and RSDs of terpene lactones in Ginkgo biloba extract from different manufacturers