牛奶是老少皆宜的营养品。牛奶中若含有抗生素,对长期饮用者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素。对抗生素过敏体质的人服用残留抗生素的乳制品后会发生过敏反应。即使是正常饮用者,体内的某些条件性致病菌易产生耐药性,一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素是奶牛场治疗奶牛乳房炎的常规药物,由于长期大量使用,使耐药菌株增加,一些乳房炎病例变得难以用常规方法治愈。这种情况又促使临诊兽医在治疗过程中加大抗生素的用量。此外,牛奶中抗生素残留会影响奶制品品质。如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等,则残留在其中的抗生素会抑制细菌的发酵,使产量和质量降低。因此市场上不允许出售抗生素残留过量的牛奶,这也会造成牛奶生产者的经济损失。2001年10月,农业部发布实施了NY 5045-2001《无公害食品生鲜牛乳》标准,明确了对新鲜牛乳的卫生指标——抗生素不得检出。2008年7月,NY 5045-2008《无公害食品生鲜牛乳》标准修改后对青霉素含量要求也是“应为阴性”。然而就中国奶牛饲养环境而言,牛奶的绝对“无抗”较难达到。针对这种情况,市场上出现了“解抗剂”,该分解剂可选择性分解牛奶中残留的 β -内酰胺抗生素,其成分就是 β -内酰胺酶。不法分子将其加入牛奶后,普通的仪器就很难检测出奶中的抗生素,从而使“有抗奶”顺利通过检测。而解抗剂的诞生也让抗生素的使用更加肆无忌惮。针对这种现象,2009年3月6日卫生部颁发了《全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治近期工作重点及要求》[ 1 ],明确规定乳及乳制品中添加 β -内酰胺酶(解抗剂)属于违法行为。
舒巴坦、他唑巴坦和克拉维酸钾均属于 β -内酰胺酶抑制剂,对青霉素酶和头孢菌素酶有强的不可逆的抑制作用,抑制剂清除后也不能使酶的活性得到恢复[ 2 ]。不法分子在含有抗生素的牛奶中加入 β -内酰胺酶以逃避抗生素的检测,为了逃避 β -内酰胺酶的检测又在牛奶中加入 β -内酰胺酶抑制剂。针对市场上出现的这种倾向,有必要研究乳制品中 β -内酰胺酶抑制剂舒巴坦、他唑巴坦和克拉维酸钾的检测方法,有效打击不法分子的违法行为,从而净化乳制品市场,切实保证消费者的利益不受侵犯。
目前,国内外有关 β -内酰胺酶抑制剂检测的报道主要着重于研究医疗用药和血清及生物样本中 β -内酰胺酶抑制剂含量的检测[ 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ]。近年来,相继有文献[ 18, 19, 20 ]报道牛奶中的舒巴坦和他唑巴坦的检测方法,但还没有牛奶中克拉维酸钾的检测方法报道。同时对牛奶中 β -内酰胺酶抑制剂的前处理研究也不够深入,现有方法还存在较大的干扰。由于乳制品含有大量的蛋白质,检测干扰因素很多,这对样品的提取技术和净化技术都提出了很高的要求。因此,本实验重点研究了纯牛奶、酸牛奶和奶粉中 β -内酰胺酶抑制剂残留的样品前处理技术及多组分同时检测的技术等内容。
高效液相色谱仪Alliance®2695 HPLC系统配2996型二极管阵列检测器(美国沃特世公司); Avanti J-E冷冻高速离心机(美国贝克曼公司); 12管固相萃取装置(美国安捷伦公司); Milli-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司);分析天平(赛多利斯北京有限公司)。
所用试剂除特别标注外均为分析纯试剂,水为超纯水;甲醇和乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司);甲酸(优级纯,美国Sigma公司);舒巴坦(CAS 68373-14-8, C8H11NO5S,纯度99.0% )、他唑巴坦(CAS 89785-84-2, C10H11N4NaO5S,纯度99.6% )、克拉维酸钾(CAS 61177-45-5, C8H8KNO5,纯度94.5% )均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;PWAX混合型弱阴离子交换固相萃取小柱(60 mg/3 mL,天津博纳艾杰尔科技有限公司),使用前用3 mL甲醇和3 mL 0.1%(如无特殊说明均为体积分数)甲酸淋洗活化。
标准溶液配制：分别准确称取10～20 mg克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦标准品,加入50%乙腈溶解,定容到100 mL作为混合标准储备溶液。该标准储备溶液于4 ℃冰箱放置,有效期为一个月。准确移取适量混合标准储备溶液,用水稀释成0.05～5 mg/L 的系列标准使用溶液。标准使用溶液应现配现用,在一天内有效。
称取4.00 g样品,置于10 mL试管中。加入丙酮混匀后定容。再倒入50 mL离心管中,于4 ℃下以 15000 r/min 离心5 min,取2.0 mL上清液于5 mL试管中。30 ℃水浴中氮吹至约0.5 mL,过柱前加入0.02%甲酸稀释到2 mL,马上转移到PWAX固相萃取小柱上。控制流速1～2滴/秒,用2 mL 0.02%甲酸和3 mL甲醇淋洗小柱。然后真空抽干,用4.0 mL含0.05%氨水的甲醇溶液洗脱。收集洗脱液,置于30 ℃水浴中氮吹近干,再用水定容到1.0 mL。混匀,用0.2 μ m聚四氟乙烯(PTFE)滤膜过滤后在12 h内检测。
称取1.00 g样品,置于10 mL试管中,加入4.0 mL水。涡旋混匀,超声波振荡10 min溶解。加入丙酮定容到10 mL,其余操作同1.3.1节。
色谱柱:资生堂CAPCELL PAK MG-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μ m);柱温:35 ℃;进样量:50 μ L;检测波长:205 nm;流速:1.0 mL/min;流动相:A为0.03%磷酸溶液,B为乙腈。梯度:0～2.0 min, 100%A; 2.0～7.0 min, 100%A～92%A; 7.0～12.0 min, 92%A; 12.0～15.0 min, 20%A; 15.0～20.0 min, 100%A。
配制质量浓度约为5 mg/L的克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦混合标准溶液,进样50 μ L,用二极管阵列检测器扫描200～400 nm,发现其最大吸收波长均为200 nm(见图1),但200 nm处基线波动和噪声较大,经比较后选择205 nm作为检测波长。
实验采用资生堂CAPCELL PAK MG-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μ m)色谱柱,该柱具有较强的耐酸碱能力。考察了纯水-乙腈体系、0.01%磷酸溶液-乙腈体系、0.02%磷酸溶液-乙腈体系、0.03%磷酸溶液-乙腈体系、0.04%磷酸溶液-乙腈体系和0.05%磷酸溶液-乙腈体系作为流动相的分离效果。结果发现,中性条件下克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦的峰形展宽严重,而提高流动相酸度有利于改善其峰形和分离度。用加标样品进行测试,结果使用0.03%磷酸溶液-乙腈体系可得到较好的峰形和良好的分离度。调整0.03%磷酸溶液-乙腈洗脱梯度如1.4节所述,克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦的标准品色谱图和加标样品分离谱图见图2。
克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦均易溶于水,采用水即可将其溶出。由于乳制品中含有大量的蛋白质,因此,考察了使用乙酸锌和亚铁氰化钾溶液、加酸调pH、甲醇和丙酮等沉淀蛋白质的方法。实验结果表明,乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白质会造成克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦的严重损失;加酸沉淀蛋白质对乳清蛋白含量高的婴幼儿奶粉效果不好,并且在酸性条件下克拉维酸钾易分解,回收率只有50%左右。实验比较了甲醇和丙酮沉淀蛋白质所需的体积。要达到较好的沉淀效果,甲醇与奶液的体积比为5 ∶ 1,丙酮与奶液的体积比为3 ∶ 2。因此,选择4.0 mL奶液加6.0 mL丙酮沉淀蛋白质,于4 ℃下以 15000 r/min 离心5 min,将上清液移至10 mL试管中备用。
由于克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦在酸性条件下均为有机酸,可采用阴离子交换柱作为固相萃取净化柱。考察了天津博纳艾杰尔科技有限公司的PWAX(60 mg/3 mL)和PAX(60 mg/3 mL)2种复合型阴离子交换柱。将净化柱用3 mL甲醇和3 mL 0.1%甲酸淋洗活化。标准溶液用0.02%甲酸稀释后过SPE柱,用2 mL 0.02%甲酸和3 mL甲醇淋洗小柱,真空抽干,用氨水-甲醇洗脱。分别收集过柱液、淋洗液和洗脱液进行检测,结果2种SPE柱均能牢固吸附克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦。但PAX柱对3种组分的保留太强,用氨水-甲醇难以洗脱;而PWAX柱则可用氨水-甲醇完全洗脱。
针对PWAX(60 mg/3mL)柱的过柱液、淋洗液和洗脱液等进行了优化。实验发现克拉维酸钾在酸性条件下易分解,且酸性越强,分解越快。为提供酸性吸附条件并保持克拉维酸钾的稳定性,采用0.02%甲酸为稀释剂。丙酮提取液直接用0.02%甲酸稀释后过柱净化,结果他唑巴坦和舒巴坦的回收率均良好,但克拉维酸钾会有约20%的损失。因此,将2.0 mL丙酮提取液于30 ℃水浴中氮吹至0.5 mL,再加入0.02%甲酸稀释到2 mL，然后转移到PWAX柱上,控制流速1～2滴/秒。结果发现,克拉维酸钾的回收率大大提高。
为了尽可能去除杂质的干扰,比较了2 mL 0.02%甲酸淋洗后再分别用1、2、3、4 mL甲醇淋洗的效果。结果发现,3 mL以上体积的甲醇淋洗已能基本去除杂质干扰,同时回收率也基本一致。因此,最终确定采用2 mL 0.02%甲酸淋洗后再用3 mL甲醇淋洗的净化方法。
实验比较了5%氨水-甲醇、2%氨水-甲醇、0.5%氨水-甲醇、0.1%氨水-甲醇和0.05%氨水-甲醇作为洗脱剂的洗脱效果。结果发现,氨水浓度高有利于3个组分的洗脱。但在强碱性条件下,氮吹过程中克拉维酸钾发生大量分解,因此洗脱液中氨水的含量也要尽可能少。比较了0.05%氨水-甲醇体积分别为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL时的洗脱效果(见图3),最终确定使用4.0 mL 0.05%氨水-甲醇洗脱小柱。
实验中发现样品溶液中有机相的含量越高越易造成色谱峰的展宽。因此,将洗脱液于30 ℃水浴中氮吹近干,再用纯水定容到1.0 mL,混匀并用0.2 μ m PTFE滤膜过滤后检测。通过比较牛奶、酸牛奶和奶粉样品净化前后的色谱图(见图4)可知，经过固相萃取净化后,样品中杂峰的干扰大大降低。
研究了纯牛奶提取液中克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦的稳定性。连续进样结果表明他唑巴坦和舒巴坦的稳定性良好,而12 h后约3% ～5%克拉维酸钾分解,18 h后约8% ～10%分解。因此,样品处理完成后应在12 h内检验完毕。对标准溶液稳定性进行跟踪测试结果也发现,他唑巴坦和舒巴坦的稳定性良好,而克拉维酸钾溶液易分解。在4 ℃冰箱放置条件下,克拉维酸钾标准储备溶液的有效期约为一个月。因此，标准使用溶液应现配现用,在一天内有效。
取标准储备液用水配成0.05～5 mg/L 的系列标准溶液,以克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦的质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准工作曲线。在0.05～5 mg/L 质量浓度范围内均呈良好的线性关系。克拉维酸钾的线性回归方程为Y=158100.6X+624.3,相关系数r=0.9998;他唑巴坦的线性回归方程为Y=135917.2X+1414.7,r=0.9997;舒巴坦的线性回归方程为Y=84999.5X+1934.4,r=0.996。
按1.3节方法处理得到0.10 mg/L 克拉维酸钾空白加标溶液的色谱峰信噪比为9.9; 0.062 mg/L 他唑巴坦空白加标溶液的色谱峰信噪比为5.8; 0.058 mg/L 舒巴坦空白加标溶液的色谱峰信噪比为5.1。按信噪比为3计,最低检测质量浓度均为0.03 mg/L。因此,本方法对牛奶和酸奶中克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦的检出限均为0.04 mg/kg,对奶粉中的这3种 β -内酰胺酶抑制剂的检出限均为0.15 mg/kg。
取不含克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦的牛奶、酸奶和奶粉3种样品进行标准添加试验,每个添加水平做6个平行试验,结果见表1。该方法对克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦的回收率在84.6% ～101.7%之间,精密度在2.2% ～7.4%之间。
采用所建立的方法对10个牛奶样品、10个酸牛奶样品和10个奶粉样品进行了检测,均未检出克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦。
本文方法采用PWAX柱固相萃取富集、净化乳制品中克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦,并用高效液相色谱-二极管阵列检测器进行检测。前处理净化效果好,检测灵敏度高,抗干扰能力强,适合在各级检验机构中推广应用,对牛奶中非法添加 β -内酰胺酶抑制剂克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦的监督工作具有积极意义。
2013, Vol. 31 Issue (5): 441-446
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