色谱柱:Waters ACQUITY Ultra BEH HILIC超高效液相色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μ m);柱温:30 ℃;样品室温度:30 ℃;进样量:5 μ L。流动相A:乙腈;流动相B: 0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0～0.2 min, 90%A; 0.2～0.4 min, 90%A～12%A; 0.4～1.8 min, 12%A; 1.8～2.2 min, 12%A～90%A。流速:0.25 mL/min。

离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子(ESI⁺)扫描;检测方式:多反应监测(MRM);毛细管电压:3.0 kV;锥孔电压:45 V;源温度:150 ℃;脱溶剂温度:450 ℃;脱溶剂气(氮气)流量:650 L/h;锥孔反吹气流量:50 L/h;碰撞气(氩气)流量:0.24 mL/min;光电倍增器电压:650 V。

称取1.0 g婴幼儿配方乳粉,加入8 mL 20%三氯乙酸溶液至完全溶解以沉淀蛋白质。取上清液分别置于4个2 mL的离心管中,均在4 ℃、15000 r/min 条件下离心10 min,合并上清液备用。

在1.3.1节处理后的沉淀中加入2 mL 0.1%盐酸溶液,放入80 ℃水浴锅中水解1 h,取出后冷却,在4 ℃、15000 r/min 条件下离心10 min。

将1.3.1节及1.3.2节中得到的两部分提取物溶液混合后,调节pH值至2.5～3,用乙腈定容至20 mL容量瓶中,用0.22 μ m有机滤膜过滤,滤液待净化。

HLB固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL超纯水预处理,然后加入上样液。先用4 mL超纯水淋洗小柱,于负压下抽干30 s,用氨水-甲醇(25 ∶ 75, v/v)溶液3 mL洗脱;收集全部洗脱液,于50 ℃下用氮气吹到近干;用1 mL初始流动相溶解并定容,过孔径为0.22 μ m的有机滤膜,滤液供UPLC-ESI-MS/MS测定。

结合唾液酸的理化性质及唾液酸在色谱柱的分配特性,分别选用基于1.7 μ m小颗粒填料技术的BEH HILIC柱(50 mm×2.1 mm和100 mm×2.1 mm)、BEH C₁₈和苯基柱4种色谱柱对唾液酸进行分离,结果表明唾液酸的保留时间有较大的差异。采用BEH C₁₈和苯基柱进行分离,在优化条件下唾液酸的保留时间分别为0.51 min和0.60 min,保留时间太短;标准品和样品检测时,信号强度差别较大,样品灵敏度均低,不适于样品检测。采用BEH HILIC柱(100 mm×2.1 mm),在优化条件下唾液酸的保留时间为2.15 min,保留时间较合理,但峰形拖尾,色谱行为不理想,灵敏度较低。采用BEH HILIC柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μ m)进行分析,发现此柱对唾液酸具有良好的分离效果和较高的灵敏度,保留时间为1.22 min,也较合适。故本实验最终选择BEH HILIC柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μ m)进行分离,采用该柱分析空白样品和加标样品的色谱图见图3。

图3

Fig. 3

图 3 (a)空白奶粉样品和(b)添加唾液酸标准品奶粉样品的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of (a) a blank infant formula sample and (b) the infant formula sample spiked with sialic acid

唾液酸是一种碳水化合物,通常以游离态或在糖蛋白或糖脂的末端以糖苷的形式存在,属于糖类。分别考察了以5 mmol/L 甲酸氨溶液-乙腈、水-乙腈、0.1%甲酸溶液-乙腈(体积比均为10 ∶ 90)为流动相对1.0 mg/L 唾液酸标准溶液的色谱分离效果,结果表明0.1%甲酸溶液-乙腈(10 ∶ 90, v/v)作流动相时的信号最强,色谱行为较好,保留时间理想。乙腈因具有优良的溶剂性能,极性较大,可以溶解多数样品,与水和醇无限互溶,并且可以改善色谱峰的峰形。在0.1%甲酸水溶液和乙腈流动相体系下,对等度洗脱与梯度洗脱进行了对比,发现等度洗脱时,色谱峰拖尾,峰形不理想。最终确定了1.2.1节的流动相及梯度洗脱程序。在0.1%甲酸水溶液和乙腈流动相体系下,唾液酸具有较高的离子化效率,因而增强了检测的灵敏度。

从不同原料中分离提取唾液酸的方法各有不同,唾液酸释放后,多数采用离子交换层析和凝胶过滤层析分离和HPLC纯化等^{[ 17 ]}。由于本实验选用了分离效果较好的色谱柱,前处理采用了水解后高速离心的处理方式,因此本方法简便、有效。水解过程中需要注意的是要使碳水化合物受到最低程度的破坏和唾液酸得到最大程度的释放。研究表明,在80 ℃条件下用0.1%盐酸水解1 h,能够使所有的唾液酸链断裂并使这些残基脱酰、脱羧化,能保证唾液酸的完全水解^{[ 17 ]}。

由于乳粉中的成分比较复杂,离心后的上清液需进行固相萃取以除去样品提取液中的杂质。目前乳粉类的样品常用的固相萃取方法主要采用反相色谱和离子交换SPE柱,还有HLB固相萃取柱。研究表明,采用聚合物填料的HLB固相萃取柱净化,可以使样品达到良好的净化效果,且方法简单、重现性好。将样品溶液加载到Oasis HLB固相萃取小柱中,采用超纯水作为淋洗液,氨水-甲醇(25 ∶ 75, v/v)溶液作为洗脱液,其中4 mL淋洗液和3 mL洗脱液即可满足净化要求。

选取不含待测组分的空白奶粉样品,按前处理方法处理制备空白基质液,并在其中添加适量的唾液酸标准品储备液,配成质量浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0和5.0 mg/L 的基质标准溶液。上机测定,记录峰面积。根据唾液酸的定量离子峰面积(Y)与唾液酸的质量浓度(X, mg/L)进行线性回归,绘制标准曲线,经Masslynx v 4.1数据处理软件分析处理,在0.05～5.0 mg/L 范围内,唾液酸的线性回归方程为Y=8114.5X-811.09, R²=0.9989。

称取1.0 g未知唾液酸含量的婴儿乳粉样品,按照建立的方法处理后进行测定;另称取1.0 g样品在前处理基础上,取约7 mL的上清液,并加入质量浓度为5.0 mg/L 标准品溶液,用乙腈定容在10 mL的容量瓶中,上机测定,得到未知样品中唾液酸的含量。依次在原含量样品的基础上分别添加0.1、0.5、2.5和5.0 mg/L 的唾液酸标准品溶液,检测后扣除空白值,计算方法的回收率。结果(见表1)表明,本方法的平均添加回收率为84.3% ～98.9% , RSD为4.9% ～8.2% ,回收率和精密度良好。在本方法的线性范围下限0.05 mg/L 时其S/N>10,故确定本方法的定量限为0.05 mg/L;以S/N=3计算方法的检出限,得到唾液酸的检出限为0.01 mg/L,表明所建立的方法具有较高的灵敏度。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表 1 婴儿乳粉样品中唾液酸的添加回收率和精密度(n=3) Table 1 Recovery and precision of sialic acid spiked in an infant formula (n=3) Spiked/(mg/L) Recovery/% RSD/% 0.1 85.7 5.7 0.5 84.3 8.2 2.5 90.8 4.9 5.0 98.9 6.9

表 1 婴儿乳粉样品中唾液酸的添加回收率和精密度(n=3) Table 1 Recovery and precision of sialic acid spiked in an infant formula (n=3)

取3份不同品牌的婴幼儿配方乳粉样品A1、B2、C3各1.0 g,按照建立的方法处理后每个样品平行测定3次,以基质匹配曲线进行定量,得到3份不同样品中唾液酸的含量分别为107.7、72.9和55.8 μ g/g。与现行方法^{[ 8, 9 ]}的测定结果进行比较,验证按本文建立的方法测定样品中唾液酸的含量在合理的范围内。