流动相A为0.025 mol/L 磷酸(用超纯水配制,加三乙胺调节pH=2.5),流动相B为乙腈,两者的体积比为50 ∶ 50;流速:1.0 mL/min;进样量:10 μ L;柱温:40 ℃;双波长紫外检测:在278 nm波长(CIP的最大吸收波长)下检测CIP,在248 nm波长(FLU的最大吸收波长)下检测FLU。

利用HPLC测定抗生素时一般采用磷酸盐缓冲液作为流动相,主要包括NaH₂PO^{[ 7 ]}₄和H₃PO₄(含三乙胺)等。而流动相的pH主要为2.5^{[ 5, 7 ]}和3.0^{[ 9 ]}。因此,本研究中考察了以下6种流动相,在其他条件与1.2节相同情况下进行对比试验,结果如表1和图1所示。

表 1 分别以6种流动相分离抗生素的拖尾因子 Table 1 Tailing factors of peaks of CIP and FLU using six mobile phases Mobile phase Mobile phase A Mobile phase B Tailing factors (standard deviation, n=7) Ciprofloxacin (CIP) Flumequine (FLU) 1 H3PO4 (pH 2.5) acetonitrile 1.58 (0.05) 2.49 (0.04) 2 H3PO4 (pH 3.0) acetonitrile 2.07 (0.16) 4.53 (0.13) 3 0.025 mol/L NaH2PO4 (adjusted pH 2.5 by H3PO4) acetonitrile 0.95 (0.04) 1.62 (0.09) 4 0.025 mol/L NaH2PO4 (adjusted pH 3.0 by H3PO4) acetonitrile 0.98 (0.02) 1.51 (0.05) 5 0.025 mol/L H3PO4 (adjusted pH 2.5 by triethylamine) acetonitrile 1.32 (0.01) 1.23 (0.03) 6 0.025 mol/L H3PO4 (adjusted pH 2.5 by triethylamine) acetonitrile 1.35 (0.01) 1.32 (0.02)

表 1 分别以6种流动相分离抗生素的拖尾因子 Table 1 Tailing factors of peaks of CIP and FLU using six mobile phases

图1

Fig. 1

图 1 不同流动相体系下(a)环丙沙星和(b)氟甲喹的色谱峰形对比 Fig. 1 Chromatograms of (a) CIP and (b) FLU under different mobile phase conditions For mobile phases 1-6, see Table 1. Mobile phase A-mobile phase B (50 ∶ 50, v/v).

如图1和表1所示,以H₃PO₄为流动相时,色谱峰对称性差,拖尾严重,其中CIP和FLU的拖尾因子分别大于1.5和2.4。以NaH₂PO₄为流动相时,色谱峰对称性亦较差,略有拖尾,其中FLU的拖尾因子大于1.5。而以H₃PO₄(加三乙胺)为流动相时,峰形较好,两种抗生素的拖尾均不明显,尤其是FLU的拖尾因子小于1.35。

同时可以看出,流动相的pH=2.5时的峰形比pH=3.0时好,说明低pH流动相条件下柱效较高。这是由于CIP和FLU在不同pH条件下存在的形态决定的。依据他人的研究结果和我们利用专业软件^{[ 10 ]}计算结果表明,CIP的pK_a1和pK_a2分别为5.64和8.87,而FLU的pK_a为5.59。CIP和FLU在不同pH条件下的形态分布如图2所示。在pH＜5.45时,环丙沙星主要以正电荷形式存在,而氟甲喹主要以中性形式存在;当流动相pH＜3.0时,超
过99%的CIP以正电荷形式存在,而大部分FLU以中性形式存在;pH越低,峰形越好。但由于pH＜2可能会影响色谱柱的柱效和寿命,因此本研究中流动相的pH选为2.5。

图2

Fig. 2

图 2 环丙沙星和氟甲喹在不同pH条件下的形态分布图 Fig. 2 Morphological distribution charts of CIP and FLU under different pH conditions

CIP为离子型化合物,具有可质子化的氮原子和可解离的羧基;FLU也具有可解离的羧基;因此两者的亲水性强,在以磷酸-乙腈为流动相时,色谱峰拖尾严重是由于这两种待测组分易与色谱柱固定相上残存的硅羟基发生作用,吸附在色谱柱的固定相上,待测组分不易流出,造成拖尾。色谱分离过程是溶质分子与溶剂分子“争夺”固定相表面的结果。流动相中加入三乙胺,其游离的－ NH₂与固定相上残存的酸性Si-OH首先相互作用,抢占了固定相上的吸附位点,降低了溶质分子与固定相的亲硅羟基效应,从而改善了分离效果。

选择流动相A为0.025 mol/L H₃PO₄(三乙胺调节pH 2.5),流动相B为乙腈,考察了两者的体积比分别为77 ∶ 23和50 ∶ 50时对不同浓度的环丙沙星与氟甲喹混合标准溶液的分离情况。结果表明:当两者的比例为77 ∶ 23时,环丙沙星峰形良好,保留时间为(4.80±0.02) min(见图3a),但氟甲喹在测定时间(30 min)内不出峰。当两者的比例为50 ∶ 50时,环丙沙星和氟甲喹的保留时间分别为(2.50±0.02) min和(7.17±0.05) min,可达到完全分离(见图3b)。

图3

Fig. 3

图 3 不同流动相比例下环丙沙星和氟甲喹混合标准溶液的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of mixed standard solution of CIP and FLU at different ratios of mobile phases a. 0.025 mol/L H3PO4 (adjusted pH 2.5 by triethylamine)-acetonitrile (77 ∶ 23, v/v)； b. 0.025 mol/L H3PO4 (adjusted pH 2.5 by triethylamine)-acetonitrile (50 ∶ 50, v/v).

样品中组分的保留时间与分配系数的关系如式(1)和式(2)^{[ 11 ]}所示:

其中,t_R为保留时间;t₀为死时间;k为保留因子(也称为质量分配系数); K为分配系数,V_s为在色谱柱中固定相的体积;V_m为流动相在色谱柱中占有的体积。

因此,样品组分的K或者k大,则保留时间长。由于反相色谱法中流动相的极性大于固定相,所以溶剂的极性增大,洗脱能力降低,样品的k值增加,t_R增大;反之,k与t_R减小。流动相中A与B的比例为77 ∶ 23时的极性比50 ∶ 50时大,洗脱能力降低,因此保留时间推迟,出峰较晚。环丙沙星的极性比氟甲喹强,根据“相似相溶”原理,环丙沙星较氟甲喹更易与溶剂结合,不易吸附到固定相上,因此环丙沙星比氟甲喹先出峰。

在10 mmol/L NaCl背景溶液中逐一添加0.1 mmol/L 和10 mmol/L 的FeCl₃、AlCl₃、CaCl₂、MgCl₂、Na₂SO₄、NaHCO₃后配制CIP与FLU的混合标准溶液并对其进行测定,与仅含10 mmol/L NaCl的原CIP与FLU混合标准溶液的峰面积进行对比(见表2)。结果表明:加入0.1 mmol/L 的Fe³⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、SO^2-₄、HCO^-₃的CIP与FLU混合标准溶液与原CIP与FLU混合标准溶液的峰面积的偏差(D)为: D_CIP＜3%(除Fe³⁺、Al³⁺外), D_FLU＜5% 。加入10 mmol/L 的Fe³⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、SO^2-₄、HCO^-₃的CIP与FLU混合标准溶液与原CIP与FLU混合标准溶液的峰面积的D值为:Ca²⁺、Mg²⁺、SO^2-₄、HCO^-₃的D_CIP＜10% , D_FLU＜5% ,而加入Fe³⁺和Al³⁺的标准溶液在测试过程中会造成基线的漂移,无法准确定量。Ca²⁺、Mg²⁺、SO^2-₄、HCO^-₃对测试结果影响较小,在允许误差范围内。低浓度的Fe³⁺和Al³⁺对测试结果影响较小,高浓度的Fe³⁺和Al³⁺影响测定可能是由于Fe³⁺、Al³⁺会与固定相表面的羟基以及测试组分发生配合作用,造成在固定相上组分分布不均或析出,导致基线漂移。在实际水体中,Fe³⁺和Al³⁺的浓度一般均小于0.1 mmol/L,因此一般情况下,这些离子的存在不会对该方法的测试造成影响。

表 2 不同浓度的离子对环丙沙星和氟甲喹测定的影响 Table 2 Influence of ions in different concentrations on CIP and FLU determinations Compound Ion concentration/ (mmol/L) Ratios of peak areas in the standard solution spiked with other ions and the standard solution/% Fe3+ Al3+ Ca2+ Mg2+ SO2-4 HCO-3 CIP 0.1 104.3 109.3 99.5 99.3 97.0 102.9 10 - - 107.8 109.5 105.0 108.2 FLU 0.1 97.3 103.2 100.3 102.3 101.5 103.0 10 - - 101.8 103.2 98.0 101.4 -: The peak areas can not be calculated because of the baseline drifting.

表 2 不同浓度的离子对环丙沙星和氟甲喹测定的影响 Table 2 Influence of ions in different concentrations on CIP and FLU determinations

分别测定1、2、5、10、20、50和100 μ mol/L 的CIP和FLU混合标准溶液各3次,以峰面积y为纵坐标、标准溶液的质量浓度x( μ mol/L)为横坐标建立标准曲线,并得到该方法的线性范围和检出限。同时对1 μ mol/L 的标准溶液测定7次,按测定结果的3倍标准偏差来计算检出限^{[ 12 ]},结果如表3所示。通过多次重复性试验,得到相同浓度的环丙沙星和氟甲喹峰面积的日内RSD＜1%(n≥3),日间RSD＜5%(n≥5),表明方法有良好的精密度。

表 3 环丙沙星和氟甲喹的线性范围、线性方程、相关系数和检出限 Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R2) and limits of detection (LOD) for CIP and FLU Compound Linear range/( μ mol/L) Linear equation R2 LOD/( μ mol/L) CIP 1-100 y=0.495×104x-250 0.998 0.3 FLU 1-100 y=0.824×104x+940 1.000 0.2 y: peak area; x: concentration, μ mol/L.

表 3 环丙沙星和氟甲喹的线性范围、线性方程、相关系数和检出限 Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R2) and limits of detection (LOD) for CIP and FLU