二氢黄豆苷原(dihydrodaidzein)、雌马酚(equol)、山姜素(alpinetin)是药理活性很高但结构有差异的黄酮类化合物。二氢黄豆苷原是二氢异黄酮类化合物,具有抗癌[ 1 ]、缓解骨质疏松[ 2 ]、预防心血管疾病[ 3 ]、提高记忆力、改善脑萎缩等生物活性;雌马酚是二氢黄烷类化合物,最为典型的生理活性为抗氧化活性,抗氧化效果优于传统的抗氧化维生素抗坏血酸和 α -生育酚;山姜素为二氢黄酮类化合物,具有抗血小板聚集活性[ 4 ]和抗微生物活性[ 5 ]。3种化合物对映体之间活性的区别尚待研究。要制备具有光学活性的黄酮进而考察其生物活性,就必需建立与之相应的手性拆分方法[ 6 ]。
Caccamese等[ 7 ]曾采用正相色谱手性柱Chiralpak AS-H和Chiralcel OD-H分离了柚皮素、高圣草素等黄酮类化合物对映体;Kwon等[ 8 ]采用毛细管电泳添加剂法成功拆分了异野樱素、橙皮素等手性黄酮类化合物。近年来,不断研究出新的方法对黄酮类化合物进行手性拆分。Jeon等[ 9 ]采用羧甲基聚糖(carboxymethylated cyclosophoraose)的方法成功拆分了儿茶素、柚皮苷等化合物;Kwon等[ 10 ]采用琥珀酸取代 α -聚糖(succinate-substituted α -cyclosophoro-octadecaoses)成功拆分了异野樱花亭、橙皮素等化合物;Si-Ahmed等[ 11 ]采用微流高效液相色谱(nano-liquid chromatography)手性柱的方法拆分了一些黄酮类化合物。磺丁基醚- β -环糊精(SBE- β -CD)已成功用于毛细管电泳分离手性化合物[ 12 ],但SBE- β -CD作为手性流动相添加剂在普通色谱柱上进行手性拆分的报道不多[ 13, 14 ]。
本研究采用SBE- β -CD为手性流动相添加剂,在反相C18色谱柱上成功拆分了二氢黄豆苷原、雌马酚、山姜素3种黄酮类化合物对映体,并对影响其拆分的主要因素(如环糊精的种类和浓度、有机相的种类和比例、缓冲盐的种类和浓度、pH等)进行了研究。方法简便,有效,对于不同结构的黄酮类化合物的手性拆分具有应用价值。
LC-20A型高效液相色谱仪,LC Solution色谱工作站(日本岛津公司); XP205型电子天平(梅特勒公司); HI98107笔式酸度计(HANNA公司)。
乙醇、甲醇、乙腈(色谱纯,J. T. Baker公司);磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、醋酸钾、磷酸二氢钠均为国产分析纯试剂; α -环糊精( α -CD)、 γ -环糊精( γ - CD)、甲基- β -环糊精(Me- β -CD)(98% ,百灵威公司), β -环糊精( β -CD)(98% ,国药集团化学试剂有限公司),SBE- β -CD(98% ,南京工业大学电光源材料研究所)。
3种二氢黄酮类化合物:二氢黄豆苷原、雌马酚购自Acros公司;山姜素购自中国食品药品检定研究院。结构式见图1。
分别称取二氢黄豆苷原、雌马酚、山姜素适量,用异丙醇溶解并稀释,制成质量浓度为0.1 g/L 的溶液,经0.45 μ m滤膜过滤后,进样分析测定。
色谱柱:Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)。流动相:乙腈-10 mmol/L SBE- β -CD水溶液(含20 mmol/L KH2PO4, pH 4.0)(体积比为20 ∶ 80)。流速1 mL/min,柱温25 ℃,进样量10 μ L。检测波长:二氢黄豆苷原为276 nm,雌马酚为280 nm,山姜素为290 nm。
以甲醇-环糊精水溶液、乙醇-环糊精水溶液和乙腈-环糊精水溶液作为流动相,考察了 α -CD(20 mmol/L)、 β -CD(20 mmol/L)、 γ -CD(20 mmol/L)、Me- β -CD(0.64 mmol/L)以及SBE- β -CD(10 mmol/L)作为手性流动相添加剂对3种黄酮类化合物手性拆分的影响。 α -CD、 γ -CD、Me- β -CD对于3种化合物均没有拆分能力。 β -CD有一定的拆分能力,但是样品不能达到基线分离,当浓度增大到30 mmol/L 后,分离效果仍没有明显改善,二氢黄豆苷原、雌马酚的分离度分别为0.3、0.5,山姜素仍不能被拆分。改用SBE- β -CD后,3种消旋体化合物基本上达到了基线分离,二氢黄豆苷原,雌马酚,山姜素的分离度分别为1.8、1.9、1.4,故选择SBE- β -CD作为手性流动相添加剂。
采用乙腈-SBE- β -CD水溶液(体积比为20 ∶ 80)为流动相,比较了SBE- β -CD浓度为5、10、20 mmol/L 时对拆分的影响,结果见表1。随着SBE- β -CD含量的增大,3个样品的保留时间均缩短,二氢黄豆苷原和山姜素的分离度增加,分别由1.7、1.3增加至1.9、1.9,雌马酚在SBE- β -CD的浓度为20 mmol/L 时,对映体保留时间短,不能完全分离。在SBE- β -CD的浓度为10 mmol/L 时,二氢黄豆苷原、雌马酚和山姜素的保留时间适宜,并且3种化合物的分离度分别为1.8、1.9和1.4,故实验中选用SBE- β -CD的浓度为10 mmol/L。
在流动相为有机溶剂-10 mmol/L SBE- β -CD水溶液(含20 mmol/L KH2PO4, pH 4.0)(体积比为20 ∶ 80)时,考察了不同有机溶剂甲醇、乙醇和乙腈对化合物拆分的影响,3种黄酮类化合物的拆分结果如图2所示。有机改性剂为甲醇时,山姜素在70 min内没有出峰,二氢黄豆苷原和雌马酚对映体可以被拆分,但拆分峰展宽、峰形差;改为乙醇后,二氢黄豆苷原、雌马酚和山姜素均可以被拆分,分离度分别为1.4、0.9和0.4;改为乙腈后,3个样品的对映体均达基线分离,且峰形良好。故选择乙腈为流动相的有机改性剂。
比较了乙腈的体积分数分别为10% 、20% 、30%时对3种黄酮类化合物手性拆分的影响(如表2所示)。二氢黄豆苷原在乙腈的比例为10% 、20% 、30%时的分离度分别为2.8、1.8、0.2;雌马酚的分离度分别为2.0、1.9、1.3;山姜素在乙腈的比例为10%时,在70 min内没有出峰,当乙腈的比例为20% ,其分离度为1.4,当乙腈的比例增加至30%时,不被拆分。二氢黄豆苷原、山姜素和雌马酚在乙腈的比例为20%时均达到良好的手性拆分效果,故选择有机改性剂乙腈的比例为20% 。
缓冲盐的存在有利于提高对映体的选择性,同时缓冲盐可以增加SBE- β -CD的溶解度,稳定化合物与SBE- β -CD所形成的包容物,增强手性识别能力[ 15 ]。本实验考察了流动相中盐的种类和含量对拆分的影响。在乙腈和5 mmol/L SBE- β -CD水溶液以20 ∶ 80的体积比组成的pH=4.0的流动相中,分别添加20 mmol/L 的KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、醋酸钾进行拆分试验。结果表明(见表3),在醋酸钾的条件下,二氢黄豆苷原和雌马酚完全被拆分,山姜素不能被拆分。在NaH2PO4的条件下,山姜素可以被拆分，其分离度为1.1；二氢黄豆苷原和雌马酚都能达到基线分离。在K2HPO4和KH2PO4的条件下,二氢黄豆苷原、雌马酚和山姜素均可以被分离。流动相中加入KH2PO4,样品的保留时间略缩短,所以流动相选择KH2PO4。
比较了KH2PO4的含量在5、10、20 mmol/L 的条件下对于拆分结果的影响。随着KH2PO4浓度增加,二氢黄豆苷原、雌马酚、山姜素3个样品的分离度变化不大,但拖尾因子有下降,峰形有改善。故选择流动相中KH2PO4的浓度为20 mmol/L。
考察了流动相pH值分别为2.0、4.0、7.0时样品的拆分情况(见图3)。当pH=2.0时,二氢黄豆苷原、雌马酚和山姜素的分离度分别为2.2、2.4和1.5;当pH=4.0时,二氢黄豆苷原、雌马酚和山姜素的分离度降低(分别为1.8、1.9和1.4);当pH=7.0时,二氢黄豆苷原和山姜素的分离度明显降低至0.7和0.4,但雌马酚的分离度增大至2.1。比较pH=2.0和pH=4.0条件下的数据,考虑延长色谱柱的使用寿命,故选择手性分离的pH为4.0。
本文以SBE- β -CD为手性流动相添加剂,对二 氢黄豆苷原、雌马酚、山姜素对映体进行了手性拆 分,方法简单、快速,分离效果好,较手性固定相法和毛细管电泳法经济适用,为这类化合物手性拆分的深入研究提供了简便实用的方法。
2013, Vol. 31 Issue (5): 447-450
PDF (784KB)
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