醋酸酐衍生-气相色谱-质谱联用测定葡萄酒中的糖醇


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周洪斌¹ , 熊治渝², 余杨¹, 万荣¹, 李平¹, 沈波¹

1. 国家食品添加剂及调味品检测重点实验室, 江苏镇江 212008;
2. 江苏大学, 江苏镇江 212013

收稿日期：2013-01-05

基金项目：国家质量监督检验检疫总局公益性科研项目(2012424012-3).

通讯作者：周洪斌.E-mail:Haoranzzj@sohu.com.

摘要：建立了先采用醋酸酐衍生然后用气相色谱-质谱联用仪检测葡萄酒中糖醇的方法。在葡萄酒中加入吡啶涡旋混合均匀,以5000 r/min (4℃)离心10 min。取上清液过有机滤膜,加入吡啶、醋酸酐衍生。加无水硫酸钠吸水后,经DB-5MS毛细管气相色谱柱分离,在选择离子监测(SIM)模式下进行检测。各目标物在0.019~1.25 mg/L (乳糖醇在0.039~2.50 mg/L)范围内线性关系良好,相关系数(r²)均大于0.99。赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇和乳糖醇的定量限(信噪比(S/N)=10)分别为0.17、0.29、0.43、0.46、0.47和2.88 mg/L;检出限(S/N=3)分别为0.05、0.08、0.13、0.14、0.14和1.38 mg/L。在40 mg/L和80 mg/L加标水平下,6种糖醇在葡萄酒基质中的回收率为80.15%~108.75%,相对标准偏差(RSD)为2.16%~6.97%。该方法的灵敏度、准确度和精密度均符合相关的技术要求,适合于葡萄酒中糖醇含量的快速检测。

关键词：衍生气相色谱-质谱糖醇葡萄酒

Determination of alditols in wine by gas chromatography-mass spectrometry after acetate derivatization

ZHOU Hongbin¹ , XIONG Zhiyu², YU Yang¹, WAN Rong¹, LI Ping¹, SHEN Bo¹

1. State Key Laboratory of Food Additive and Condiment Testing, Zhenjiang 212008, China;
2. Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

Received: 2013-01-05

Abstract: The acetate derivatization of alditols for determining alditol level in wine by gas chromatography (GC)-mass spectrometry (MS) has been developed. The wine sample was mixed with pyridine and centrifuged at 5000 r/min at the temperature of 4℃ for 10 min. After filtration with organic phase membrane, the supernatant was derivatized with acetic anhydride, and then dehydrated with anhydrous sodium sulfate. The GC separation was performed on a DB-5MS capillary column. The alditols were determined by MS in selected ion monitoring (SIM) mode and quantified by external standard method. The calibration curves showed good linearities in the range of 0.019-1.25 mg/L except for lactitol (0.039-2.50 mg/L) with the correlation coefficients greater than 0.99. The limits of quantification (S/N=10) of erythritol, xylitol, D-mannitol, sorbitol, galactitol and lactitol were 0.17, 0.29, 0.43, 0.46, 0.47 and 2.88 mg/L respectively. The limits of detection (S/N=3) were 0.05, 0.08, 0.13, 0.14, 0.14 and 1.38 mg/L respectively. The recoveries of alditols spiked in the wine at two levels of 40 mg/L and 80 mg/L were ranged from 80.15% to 108.75% with the relative standard deviations (RSDs) of 2.16%-6.97%. The sensitivity, accuracy and precision of the method can meet the technical standard. The method can be applied to the rapid determination of alditols in wine.

Key words: derivatization gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) alditol wine

近年来中国进口葡萄酒的数量呈逐年上升之势,与此同时进口葡萄酒被检出标签不合格、重金属超标、添加剂超限量使用的情况时有发生。因此加强进口葡萄酒的监测,发现潜在的风险亦已成为一种共识。糖醇是醛糖或酮糖的羰基被还原成羟基的衍生物。一部分多元醇广泛存在于植物以及微生物体内,存在的形式有游离状态及化合状态。糖醇虽然不是糖但具有某些糖的属性,如其作为甜味剂可取代食糖而广泛应用于食品工业中。目前人工合成的用于食品工业的糖醇包括山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇、木糖醇等,这些糖醇对酸、热有较高的稳定性,不容易发生美拉德反应。葡萄酒中的糖醇种类、含量对酒的风味有较大的影响。从业内的信息看,在酒中加入某些多糖对提高香气复杂性、浓郁度有很好的帮助^{[ 1 ]}。根据GB 2760-2011《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》^{[ 2 ]},葡萄酒中不得添加任何形式的糖醇,对各国进口葡萄酒进行本底调查,建立相关产地葡萄酒中糖醇的种类、含量的信息库显得尤为必要。目前国内外对食品中糖醇的检测方法包括:高效液相色谱-蒸发光散射法^{[ 3 ]}、高效液相色谱-示差折光检测法^{[ 4 ]}、高效液相色谱-紫外检测法^{[ 5 ]}、离子排斥液相色谱法^{[ 6 ]}、气相色谱法^{[ 7 ]}、气相色谱-质谱法(GC-MS)^{[ 8 ]}、液相色谱-串联质谱法^{[ 9, 10, 11 ]}等。离子排斥液相色谱法、气相色谱法适用于检测没有使用限量规定的糖醇。对于不允许使用的糖醇,阳性检测结果往往需要对其化学结构进行鉴定。气相色谱-质谱法中采用的方法需要将样品衍生后再氮吹复溶,然后进样,耗时较长,影响检测周期。而采用液相色谱-串联质谱法检测葡萄酒中的糖醇,则未见相关报道。

本法采用了葡萄酒样品加入吡啶,涡旋混合离心后直接衍生,加无水硫酸钠吸水后,用气相色谱-质谱联用仪检测6种糖醇(赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、乳糖醇)的方法,克服了上述方法中定性缺陷或耗时较长的不足,具有较高的灵敏度和良好的稳定性,适合葡萄酒中糖醇含量的大批量检测工作。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Thermo Scientific ISQ质谱仪,配电子轰击离子源(EI)(Thermo Scientific公司); Thermo Scientific AS300自动进样器;Thermo Scientific Trace GC Ultra气相色谱;XW-80A涡旋混合器(上海医科大学仪器厂); H-2050R高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司); Milli-Q超纯水一体机(Millipore公司);吡啶、硫酸钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);醋酸酐(分析纯,上海炎晨化工实业有限公司); 6种糖醇标准品(纯度均大于99% , Dr. Ehrenstorfer公司)。

1.2 溶液配制

准确称取适量的6种糖醇标准品,用超纯水配制成质量浓度为1000 mg/L 的标准储备液,置于4 ℃冰箱中保存。以吡啶将6种储备液稀释成7个不同质量浓度的混合标准工作液。其中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇的质量浓度范围为0.019～1.25 mg/L,乳糖醇的质量浓度范围为0.039～2.50 mg/L。

1.3 样品来源

样品为全国口岸进口的法国、智利、澳大利亚、意大利、南非、西班牙等国的葡萄酒,共计108批。

1.4 样品前处理及衍生化

吸取葡萄酒样品1.0 mL,加入7.0 mL吡啶(在回收率试验中,加入适当浓度的标准溶液1.0 mL以及6.0 mL吡啶),混合均匀。以 5000 r/min (4 ℃)离心10 min。取上清液过有机相膜备用。

吸取过膜后的样品溶液100 μ L,加入900 μ L吡啶以及 1000 μ L醋酸酐,涡旋混合均匀,于70 ℃水浴30 min。取出冷却至室温,在衍生管中加入1.0 g无水硫酸钠,涡旋1 min,以 5000 r/min (4 ℃)离心10 min,取上清液过膜装瓶进样。

1.5 GC-MS条件

1.5.1 GC条件

DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m, Agilent公司);载气为氦气(纯度为99.999% );流速:1.0 mL/min;进样量:1.0 μ L,不分流进样。进样口温度:250 ℃。程序升温条件:初始柱温110 ℃,保持1 min;以20 ℃/min 速率升温至160 ℃,保持0 min;以1 ℃/min 速率升温至200 ℃,保持0 min;以25 ℃/min 速率升温至305 ℃,保持4.5 min。

1.5.2 MS条件

溶剂延时:5 min;离子化模式:电子轰击(EI);电离能量:70 eV;离子源温度300 ℃; GC-MS接口温度:280 ℃;选择离子监测(SIM)模式。各糖醇衍生物的保留时间和特征离子等参数见表1。

表 1 6种糖醇衍生物的保留时间和特征离子参数 Table 1 Retention times and characteristic ions of acetate derivatives of the six alditols

Compound	Retention time/min	Quantitative ion(m/z)	Base peak intensity/%	Qualitative ion(m/z)	Intensity of qualitative ion/%
Erythritol	8.42	115.05	100	103.19	74
				128.13	33
				145.14	55
Xylitol	17.49	115.05	100	103.12	52
				127.10	33
				145.12	42
D-Mannitol	29.51	115.05	100	139.05	65
				145.08	45
				128.15	41
				187.08	34
Sorbitol	29.80	115.05	100	139.05	46
				145.08	40
				128.15	42
				187.08	30
Galactitol	30.74	115.05	100	139.05	55
				145.08	34
				128.15	32
				187.08	35
Lactitol	50.40	115.05	100	109.05	18
				153.15	11
				169.08	16

表 1 6种糖醇衍生物的保留时间和特征离子参数 Table 1 Retention times and characteristic ions of acetate derivatives of the six alditols

2 结果与讨论

2.1 GC条件的选择

由于甘露糖醇、山梨糖醇和半乳糖醇的相对分子质量均为182.17,且甘露糖醇为山梨糖醇的异构体。因此若升温速度过快,无法将甘露糖醇和山梨糖醇的衍生物分开。在柱温箱温度达到160 ℃时,以1 ℃/min 速率升温至200 ℃并保持0 min,可以有效分离这两个峰,分辨率为1.12(见图1)。

图 1 甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇衍生物的总离子流 Fig. 1 Total ion chromatogram of acetate derivatives of D-mannitol, sorbitol and galactitol

2.2 离子源温度的影响

离子源温度对标准品的信号响应值影响较大。实验过程中发现,随着离子源温度的升高,糖醇衍生物的灵敏度相应增加。但是温度过高可能会使离子源材料和部件受损,缩短离子源寿命。考虑到离子源的使用温度上限(＜350 ℃)以及实际检测的技术要求,最终将离子源的温度设定成300 ℃。

2.3 过量的醋酸酐对仪器的影响

采用衍生化方式测定糖醇,需要过量的醋酸酐。从108批样品的检测数据比较看,过量的醋酸酐对仪器没有影响。首先,DB-5MS毛细管柱在反复使用6个月后,对6种糖醇衍生物的保留没有太大的变化,6种糖醇衍生物保留时间的位移均在±0.03 min之间,符合技术要求。从仪器调谐的情况看,在测定糖醇之前倍增器(multiplier)的电压为 1232.3 V,所有样品测定完毕后再次调谐,倍增器的电压为 1233.7 V,说明检测器没有受到污染。

2.4 标准品以及加标样品衍生物分离的效果

在1.5节条件下,6种糖醇衍生物均能有效分离。样品加标后会出现一些衍生物的杂峰,但均不在6种糖醇衍生物的出峰处,对检测结果没有影响(见图2和图3)。

图 2 6种糖醇标准混合溶液衍生物的总离子流图 Fig. 2 Total ion chromatogram of acetate derivatives of the six alditols

图 3 葡萄酒样品加标测定时的总离子流图 Fig. 3 Total ion chromatogram of acetate derivatives of a wine sample spiked with the six alditols

2.5 线性关系、检出限及定量限

在1.5节中优化的条件下,以峰面积为纵坐标(y),以糖醇含量为横坐标(x, mg/L)进行线性回归,得到回归方程和相关系数;同时进行样品添加试验,分别以信噪比(S/N)为3和10确定各糖醇在红酒样品中的检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果见表2。

表 2 6种糖醇的线性关系、LOD和LOQ Table 2 Linear relationships, LODs (S/N=3) and LOQs (S/N=10) of the six alditols

2.6 实际样品检测及回收率试验

从108批葡萄酒的检测结果看,乳糖醇的测定结果都低于检出限,其他5种糖醇均有检出(部分数据见表3)。无论是欧洲还是南美的葡萄酒,木糖醇(5.36～9.41 mg/L)和半乳糖醇(9.99～11.46 mg/L)的含量都不高。而赤藓糖醇(55.88～113.97 mg/L)、甘露糖醇(37.86～308.19 mg/L)、山梨糖醇(61.20～157.11 mg/L)的含量显然要高得多。澳大利亚进口的30批葡萄酒中赤藓糖醇(113.97 mg/L)、甘露糖醇(308.19 mg/L)、山梨糖醇(157.11 mg/L)的含量要明显高于其他产地的葡萄酒。在实际样品中进行了两个水平的加标回收试验，具体结果见表3。

表 3 各国葡萄酒中6种糖醇的含量及加标回收率(n=6) Table 3 Contents of the six alditols in wine imported from different countries and the spiked recoveries (n=6)

Export country	Batch number	Compound	Background/(mg/L)	Spiked at 40 mg/L			Spiked at 80 mg/L
Export country	Batch number	Compound	Background/(mg/L)	Found/(mg/L)	Recovery/%	RSD/%	Found/(mg/L)	Recovery/%	RSD/%
Italy	17	erythritol	56.50	100.00	108.75	4.86	137.44	101.18	4.06
		xylitol	5.36	41.01	89.12	3.93	78.45	91.36	3.72
		D-mannitol	37.86	79.89	105.08	5.01	120.66	103.50	4.67
		sorbitol	61.70	102.21	101.28	5.14	141.33	99.54	4.20
		galactitol	10.07	42.13	80.15	5.28	79.49	86.78	3.75
		lactitol	≤1.38	39.16	95.40	4.01	78.52	98.15	2.98
France	26	erythritol	55.88	97.16	103.20	5.13	135.28	99.25	5.09
		xylitol	5.61	41.74	90.32	4.26	81.82	95.26	4.12
		D-mannitol	128.79	168.10	98.28	2.59	208.09	99.14	2.33
		sorbitol	61.62	100.24	96.55	4.67	142.61	101.24	4.49
		galactitol	10.40	43.38	82.45	5.13	80.20	87.25	4.82
		lactitol	≤1.38	38.75	96.88	5.29	77.93	97.41	4.07
Spain	15	erythritol	60.40	100.50	100.25	2.26	139.00	98.25	2.21
		xylitol	5.79	44.04	95.62	4.14	82.77	96.22	4.12
		D-mannitol	49.40	91.00	104.00	3.68	124.81	94.26	3.87
		sorbitol	73.19	108.33	87.85	6.03	147.96	93.46	5.65
		galactitol	10.54	43.62	82.70	5.84	79.40	86.08	6.01
		lactitol	≤1.38	36.18	90.45	3.77	78.03	97.54	4.06
Australia	30	erythritol	113.97	153.98	100.02	3.54	191.43	96.82	3.29
		xylitol	9.41	46.47	92.65	4.12	85.70	95.36	4.19
		D-mannitol	308.19	343.74	88.88	6.97	380.01	89.78	5.28
		sorbitol	157.11	193.74	91.58	6.01	229.66	90.69	5.01
		galactitol	11.46	46.96	88.75	4.99	83.73	90.34	4.62
		lactitol	≤1.38	36.34	90.85	3.68	109.48	91.42	3.54
South Africa	9	erythritol	107.71	143.98	90.68	5.17	186.29	98.22	5.14
		xylitol	6.55	44.66	95.28	4.52	89.32	103.46	3.97
		D-mannitol	50.23	87.95	94.30	3.83	131.71	101.85	3.63
		sorbitol	113.49	154.44	102.38	4.03	189.90	95.51	3.98
		galactitol	9.99	43.41	83.55	3.75	81.94	89.94	3.57
		lactitol	≤1.38	40.18	100.45	4.76	74.87	93.59	5.01
Chile	11	erythritol	73.51	115.06	103.88	2.16	147.65	92.68	3.01
		xylitol	7.95	48.98	102.58	3.48	84.39	95.55	3.27
		D-mannitol	42.87	81.61	96.85	3.66	119.93	96.32	3.57
		sorbitol	68.09	106.27	95.45	4.09	151.50	104.26	4.16
		galactitol	10.19	45.11	87.30	4.25	82.65	90.58	3.62
		lactitol	≤1.38	38.91	97.28	4.32	75.05	93.81	4.36

表 3 各国葡萄酒中6种糖醇的含量及加标回收率(n=6) Table 3 Contents of the six alditols in wine imported from different countries and the spiked recoveries (n=6)

3 结论

建立了先采用醋酸酐衍生然后用气相色谱-质谱联用仪检测葡萄酒中糖醇的方法。该方法简化了样品前处理的步骤,对来源于法国、意大利、南非等国的葡萄酒中6种糖醇的含量进行了测定。该方法的灵敏度、准确度和精密度均符合相关的技术要求,适用于葡萄酒中糖醇含量的快速检测。

参考文献

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... 从业内的信息看,在酒中加入某些多糖对提高香气复杂性、浓郁度有很好的帮助^{[ 1 ]} ...

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... 根据GB 2760-2011《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》^{[ 2 ]},葡萄酒中不得添加任何形式的糖醇,对各国进口葡萄酒进行本底调查,建立相关产地葡萄酒中糖醇的种类、含量的信息库显得尤为必要 ...

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... 目前国内外对食品中糖醇的检测方法包括:高效液相色谱-蒸发光散射法^{[ 3 ]}、高效液相色谱-示差折光检测法^{[ 4 ]}、高效液相色谱-紫外检测法^{[ 5 ]}、离子排斥液相色谱法^{[ 6 ]}、气相色谱法^{[ 7 ]}、气相色谱-质谱法(GC-MS)^{[ 8 ]}、液相色谱-串联质谱法^{[ 9, 10, 11 ]}等 ...

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