色谱  2013, Vol. 31 Issue (5): 423-428   PDF (512KB)    
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范超
宋子凤
秦伟捷
蔡耘
钱小红
新型亲水聚合物修饰硅胶颗粒固定化酶的制备及在蛋白质组鉴定中的应用
范超1,2, 宋子凤2, 秦伟捷2 , 蔡耘2 , 钱小红2    
1. 安徽医科大学研究生学院, 安徽 合肥 230032;
2. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京蛋白质组研究中心, 蛋白质组学国家重点实验室, 北京 102206
收稿日期：2013-01-05
基金项目：国家重大科学计划项目(2013CB911204);国家重大科学仪器设备开发专项项目(2011YQ09000504);国家自然科学基金项目(21275005,21235001).
通讯作者：蔡耘,Tel:(010)80727777-1129,E-mail:Caiy_2007@yahoo.com.cn;秦伟捷,Tel:(010)80727777-1142,E-mail:aunp_dna@126.com.
摘要：采用原子转移自由基聚合法制备了亲水聚合物修饰的硅胶颗粒作为一种新型固定化酶载体,在实现胰蛋白酶高密度固定的同时,显著降低了载体材料非特异性吸附导致的样品损失。因此,该固定化酶材料兼具高酶解效率和高回收率的特性。以标准蛋白质牛血清白蛋白(BSA)为样本,使用该固定化酶1 min即可完成酶解,鉴定到肽段对BSA的氨基酸序列覆盖率可达90%以上。该固定化酶材料成功应用于酵母菌全蛋白质复杂样本的酶解,从3 min酶解产物中鉴定到666个蛋白质,超过同样条件下溶液酶解12 h的鉴定结果。
关键词： 固定化酶     蛋白质组学     原子转移自由基聚合反应    
A novel immobilized trypsin on hydrophilic polymer modified silica beads for proteome characterization
FAN Chao1,2, SONG Zifeng2, QIN Weijie2 , CAI Yun2 , QIAN Xiaohong2    
1. Graduate Department of Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
2. State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 102206, China
Received: 2013-01-05
Abstract: A new type of immobilized trypsin was prepared using hydrophilic polymer modified silica microparticles (HPMSM) synthesized by atom transfer radical polymerization (ATRP) as the substrate material. ATRP modification led to densely packed hydrophilic polymer chains grafted on the microparticles surface which resulted in largely increased trypsin loading amount and minimized the nonspecific adsorption of proteins and peptides. Therefore, ultra-fast and highly efficient protein digestion was achieved with minimized sample loss. For standard protein bovine serum albumin (BSA), 1 min digestion led to the identification of 93 peptides, which covered 91% amino acid sequence of the protein. This immobilized trypsin was further successfully applied to the digestion of complex protein samples from yeast and 666 proteins were identified after 3 min digestion, which exceeded the number of identified proteins after 12 h solution digestion.
Key words: immobilized trypsin     proteomics     atom transfer radical polymerization (ATRP)    

目前应用最为广泛的蛋白质组学研究策略是基于多维色谱分离和质谱鉴定的“鸟枪法”(shot-gun method)策略[ 1, 2 ]。在该策略中,蛋白质样品在蛋白酶的作用下被酶解为肽段混合物,之后通过二维液相色谱-串联质谱(MS/MS)分析对肽段进行鉴定[ 3, 4 ],将所得到的数据运用MASCOT或SEQUEST等软件配合数据库进行搜索,从而得到蛋白质的鉴定结果。在此策略中,蛋白质定性、定量信息是通过对相应的肽段进行分析而获得,因此蛋白质快速、高效、完全的酶解就成了蛋白质组准确、高通量鉴定以及定量研究中极其重要的环节。然而,在传统的溶液酶解中为了避免蛋白质酶自身酶解,往往需使用较低的蛋白酶比例(蛋白酶 ∶ 蛋白质底物=1 ∶ 50～1 ∶ 100)[ 5 ],因此酶解反应通常需要12 h以上[ 6, 7, 8 ],即便如此,对于高度复杂的样品仍然难以实现完全酶解,从而影响了样品分析通量和定量研究的准确度。为此,固定化酶应运而生,固定化酶[ 9, 10, 11 ]避免了蛋白酶自身酶解,因此可使用更高的酶/底物比,从而大幅度缩短了酶解所需时间,同时兼备可重复使用等优点。然而传统载体材料多为疏水性材料,对蛋白质和肽段的非特异性吸附严重,导致样品损失,影响定性和定量结果[ 12, 13 ]。因此,本实验采用原子转移自由基聚合反应(ATRP)[ 14, 15, 16 ],在硅胶颗粒表面原位生成大量非交联的亲水聚合物链。聚合物链上的大量功能基团可实现高负载量的蛋白酶固定,从而大幅度提高了酶解效率和完全性。同时,聚合物链修饰显著提高了硅胶颗粒的亲水性,降低了非特异性吸附导致的样品损失,因而有助于提高规模化蛋白质鉴定的灵敏度和定量的准确性。



1 实验部分
1.1 仪器与试剂

主要仪器:4800基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF-TOF MS,美国,AB SCIEX公司);毛细管高效液相色谱-电喷雾-线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(RPLC-ESI-LTQ-FT MS,美国Thermo Fisher Scientific公司),安捷伦1100毛细管色谱系统(美国,Agilent公司);真空冰冻干燥机SC100A Speedvac Plus (美国,Thermo Savant公司); Sartorius BP211d分析天平(德国,Sartorius公司); 3K30型高效离心机(美国,Sigma公司); NanoDrop 2000c超微量分光光度计(美国,Thermo Fisher Scientific公司)。

主要试剂:马心肌红蛋白(MYO, 90% ), 牛血清白蛋白(BSA, 98% ); α -氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA, 95% ),三氟乙酸(TFA, 99% ),三甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA, 97% ), N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺(98% ),氨基葡萄糖盐酸盐购自美国Sigma公司;1,4-二硫苏糖醇(DTT, 98% )和碘乙酰胺(IAA, 98% ),胰蛋白酶(15276 u/mg),购自美国Promega公司;色谱级乙腈(ACN)购自美国J. T. Baker公司;3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, 3-APTES, 99% )、3- 丙磺酸内盐(CHAPS, 98%)和氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride, 99.5% )购自美国Acros公司;高碘酸钠购自北京化学试剂公司;酵母菌购自美国Sigma公司;所有实验用水由Milli-Q纯水系统提供(美国,Millipore)。

1.2 实验方法
1.2.1 甲基丙烯酰胺葡萄糖单体(GMA-G)制备

取1 mL甲基丙烯酸缩水甘油酯与适量0.2 mol/L 硫酸混合反应后,加入10 mmol/L 高碘酸钠,用锡箔纸包裹避光反应4 h。称取1.1 g盐酸氨基葡萄糖溶于20 mL甲醇中于磁力搅拌器上搅拌6 h生成淡黄色溶液。将高碘酸钠处理后的甲基丙烯酸缩水甘油酯反应液逐滴加入此淡黄的溶液中搅拌过夜。氮气吹干至4 mL, 4 ℃保存待用。

1.2.2 硅胶固定化酶制备

引发剂 合成的具体步骤如文献[ 14, 15, 16 ]中报道。将引发剂溶解在95%乙醇中,使其终浓度为74 g/L。引发剂和硅胶颗粒混合,室温反应6 h,用甲醇清洗掉剩余引发剂后,加入ATRP反应液(2 mol/L GMA-G, 0.01 mol/L CuCl, 0.001 mol/L CuCl2, 0.015 mol/L N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺)封口,60 ℃振摇反应4～6 h。聚合反应结束后,用甲醇清洗去除剩余反应液。加入10 mmol/L 高碘酸钠,用锡箔纸包裹避光,置于旋转混匀器上室温反应4 h。反应结束后,用大量去离子水清洗聚合物修饰硅胶颗粒,之后加入胰蛋白酶溶液(2 g/L),置于旋转混匀器上4 ℃过夜。采用NanoDrop 2000c超微量分光光度计测定胰蛋白酶固定前后其在反应液中的浓度变化,结合反应液体积计算出固定到亲水聚合物修饰的硅胶颗粒(HPMSM)上的胰蛋白酶量。3次重复测定,取平均值得到HPMSM的胰蛋白酶负载量。完成HPMSM-胰蛋白酶的制备后使用50 mmol/L 碳酸氢铵溶液清洗,备用。

1.2.3 硅胶颗粒固定化酶酶解标准蛋白质

见文献[ 17 ]1.2.2节。

1.2.4 酵母菌全蛋白质提取

称取50 mg酵母菌粉体,悬浮于蛋白质提取液(50 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L 尿素,4%CHAPS, 2 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA),蛋白酶抑制剂),超声破碎细胞,超声条件为冰浴上超声2 s间隔2 s,超声总时间为2 min。然后将裂解液在4 ℃和 20000 g离心力下离心20 min,去除未破碎细胞及碎片,上清液即为酵母菌全蛋白质。在提取的蛋白质溶液中加入4～5倍体积的冷丙酮(-20 ℃预冷), -20 ℃放置超过2 h。于4 ℃下高速离心(12000 g) 10 min,仔细吸取上清液,保留沉淀。将沉淀放置于通风橱中,使吸附在沉淀上的丙酮充分挥发。最后将丙酮沉淀得到的蛋白质重新溶解在8 mol/L 尿素缓冲液中,置于-80 ℃保存备用。

1.2.5 硅胶颗粒固定化酶酶解酵母菌全蛋白质

在酵母菌提取的全蛋白样本中加入DTT(10 mmol/L),在37 ℃水浴中还原4 h后,冷却至室温,加入IAA(50 mmol/L)暗处放置1 h后进行烷基化。取50 μ L处理好的蛋白质溶液,在其中加入150 μ L(50 mmol/L)碳酸氢铵溶液,终体积为200 μ L,加入到硅胶颗粒固定化酶中,混匀后置于37 ℃水浴中3 min,然后通过离心将硅胶颗粒固定化酶从酶解反应体系中分离出来,取上清液。用水进行5倍稀释后,于15000 g离心力下离心15 min,用RPLC-ESI-LTQ-FT MS系统进行分离和鉴定。

1.2.6 质谱鉴定

MALDI-TOF质谱鉴定、液相色谱-质谱联用系统(RPLC-ESI-MS/MS)鉴定分析及ESI-LTQ-FT MS条件同文献[ 17 ]1.2.5节。

2 结果与讨论
2.1 HPMSM固定化胰蛋白酶(HPMSM-trypsin) 的制备与表征

新型亲水聚合物硅胶颗粒固定化胰蛋白酶的制备原理和流程如下：首先将引发剂 通过Si-O键连接在硅胶颗粒表面,之后与GMA-G单体进行ATRP聚合反应,在硅胶颗粒表面原位生长出大量线性亲水聚合物链。聚合反应结束后,用大量甲醇对硅胶颗粒上的剩余反应液进行清洗。之后,使用高碘酸钠将GMA-G聚合物链的侧链葡萄糖上的邻二羟基氧化为醛基,进而与胰蛋白酶的氨基通过希夫碱反应将胰蛋白酶固定到聚合物链上。

利用场发射扫描电镜(FESEM)对聚合物链修饰的硅胶颗粒以及未经任何处理的硅胶颗粒进行表面微观结构表征(见图1)发现,经ATRP反应处理可在硅胶颗粒表面生成大量纳米尺度的颗粒状聚合物修饰涂层,聚合物颗粒修饰分散均匀,尺度较为均一,对硅胶颗粒包裹完整,无明显裸露,证明了引发剂固定的高效性以及聚合物原位生长的高度可控性。ATRP修饰后的硅胶颗粒仍保持了原有的分散性,未见颗粒发生交联或聚集,证明了硅胶颗粒表层的聚合物修饰均为表面原位引发ATRP反应获得。为了进一步证明使用ATRP法在硅胶颗粒表面进行聚合物链修饰的高效性,对HPMSM和未经处理的硅胶颗粒进行热重分析。HPMSM包括可热分解的聚合物链外壳和不可热分解的硅胶内核两部分。从图2中可以看出,未经任何处理的硅胶颗粒在100～700 ℃温度范围重量损失约3.8% ,这可能是样品中残留水分导致的质量的损失,而聚合物链修饰的硅胶颗粒在加热过程中质量损失达10% ,显示硅胶颗粒表面有大量聚合物包裹,从而可以大幅提高胰蛋白酶的负载量。通过测定胰蛋白酶固定前后其在反应液中的浓度变化,计算出固定到HPMSM上的胰蛋白酶量。3次重复测定结果取平均值得到 HPMSM的胰蛋白酶负载量为51.75 mg/g。与文献报道采用传统方法制备的单层蛋白酶修饰固定化酶颗粒(18.1 mg/g)[ 18 ]相比,负载量有明显提高,证明硅胶表面生成的聚合物大大增加了胰蛋白酶的负载量。

图 1 (a)未经任何处理的硅胶颗粒和(b) HPMSM的扫描电镜图 Fig. 1 SEM images of (a) silica beads without any treatment and (b) HPMSM
图 2 (a)未经任何处理的硅胶颗粒及(b)HPMSM的热重分析图 Fig. 2 Thermogravimetric analyses of (a) silica beads without any treatment and (b) HPMSM

传统固定化酶多使用疏水性材料作为载体,对蛋白质样品往往存在非特异性吸附,导致样品损失,因此影响了定性研究的灵敏度和定量研究的准确度。鉴于以上原因,我们在硅胶颗粒表面修饰了具有较强亲水性的甲基丙烯酰胺葡萄糖聚合物链,在提高胰蛋白酶固载量的同时显著降低了载体材料的疏水性。为了考察载体材料的亲水性,将未经修饰的硅胶颗粒和HPMSM分别分散于乙腈溶液中。从图3中可以看出,未经修饰的硅胶颗粒在乙腈接触时分散良好,而HPMSM在乙腈中迅速团聚,在2～5 s内就完全团聚沉降在EP管底部。然而在水溶液中,2 min后未经修饰的硅胶颗粒已经沉淀于EP管底部,而HPMSM则均匀分散,5 min后未见明显沉淀,证明亲水聚合物修饰的HPMSM材料具有很好的亲水性。为了考察HPMSM亲水性载体材料对蛋白质的非特异性吸附情况,分别将荧光标记的BSA与HPMSM和未经修饰的硅胶颗粒混合孵育。从图4中可以看出,未经修饰的硅胶颗粒对荧光蛋白有明显吸附。孵育后有大量荧光蛋白质残留在硅 胶颗粒表面,即便使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)反复清洗后,仍有部分荧光蛋白质无法除去。相反,HPMSM在与荧光蛋白质孵育后,只有极为微量的荧光蛋白质吸附,经PBS清洗后,吸附的荧光蛋白质被完全去除,证明亲水聚合物修饰的HPMSM材料具有很好的抗非特异性吸附能力,可有效降低蛋白质样品损失。

图 3 未经聚合物修饰的硅胶颗粒及HPMSM在不同溶剂中的分散程度 Fig. 3 Dispersity characterization of silica beads without any treatment and HPMSM in different solvents a. silica beads (left) and HPMSM (right) in acetonitrile; b. silica beads (left) and HPMSM (right) in water.
图 4 (a,b)未经聚合物修饰的硅胶颗粒及(c,d)HPMSM与荧光蛋白质孵育后的荧光显微镜照片 Fig. 4 Representative fluorescence microscopy photographs of (a, b) silica beads without any treatment and (c, d) HPMSM incubated with FITC-BSA a, c. before PBS washing; b, d. after PBS washing.
2.2 标准蛋白质的酶解效率考察

采用BSA来考察HPMSM-trypsin的酶解效率。BSA的相对分子质量为 66000 Da,具有17个二硫键,3个结构域,空间结构相对复杂,具有一定的代表性。将 1000 μ g BSA变性后与HPMSM-trypsin混合,置于37 ℃水浴中孵育1 min后,采用离心方法将HPMSM-trypsin与酶解产物分离,吸取上清液中的酶解肽段进行MALDI-TOF-MS质谱表征,所得结果如图5a所示。谱图中存在大量酶解肽段所对应的质谱峰,说明BSA被成功酶解为肽段。在允许1个漏切位点的条件下,HPMSM-trypsin酶解所鉴定到的93条肽段对BSA的氨基酸序列覆盖率可达到91% ,而传统的溶液酶解12 h所得肽段对BSA的氨基酸序列覆盖率仅为71% ,证明HPMSM-trypsin具有快速、高效酶解蛋白质的能力。为了考察蛋白质快速酶解后是否存在酶解不完全的现象,将HPMSM-trypsin与100 μ g BSA混合,酶解1 min后,使用MALDI-TOF-MS质谱线性模式考察酶解产物中是否存在未完全酶解的蛋白质或相对分子质量大的肽段残留。如图5b所示,在m/z 10000 到m/z 100000 的范围内没有观察到任何残留蛋白质或相对分子质量大的肽段对应的质谱信号。由上述结果可以推测ATRP法制备的HPMSM-trypsin不但具有超快的酶解速度和较高的酶解效率,并且具有较好的酶解完全性。我们认为上述优势是由于本实验采用ATRP法在硅胶颗粒表面原位生成大量非交联的亲水聚合物链,聚合物侧链上的大量功能基团实现了高密度的胰蛋白酶固定,从而显著提高了胰蛋白酶固载量。

图 5 HPMSM-trypsin酶解BSA的MALDI-TOF质谱图 Fig. 5 MALDI-TOF mass spectra of BSA digested by HPMSM-trypsin a. in reflection mode; b. in linear mode.
2.3 酶解稳定性考察

在传统溶液酶解中,蛋白质酶解反应通常需要通过酸化、加热等方式变性蛋白酶来终止酶解反应,而HPMSM-trypsin可通过离心分离使HPMSM-trypsin从酶解体系中分离出来,既可终止酶解反应,又可回收使用。采用同一批HPMSM-trypsin, 8次重复酶解BSA来考察重复使用的HPMSM-trypsin的酶活性及酶解稳定性。从图6可以看出,8次酶切产物中鉴定到的肽段对BSA的氨基酸序列覆盖率稳定在88%到96%之间,均超过12 h常规溶液酶解71%的序列覆盖率。8次固定化酶解产物肽段对BSA的平均覆盖率为91% ,相对标准偏差(RSD)为2.49% 。说明硅胶颗粒固定化酶可以多次重复使用,酶活性无明显下降,且酶解效率具有较好的稳定性和重现性。

图 6 HPMSM-trypsin酶解BSA的稳定性和重现性考察 Fig. 6 Stability and reproducibility of HPMSM-trypsin with BSA as a model protein
2.4 在酵母菌蛋白质组酶解和鉴定中的应用

为了考察HPMSM-trypsin对复杂蛋白质组样品的适用性,本实验采用酵母菌全蛋白质作为实际样品,通过采用RPLC-ESI-MS/MS对酶解肽段产物进行鉴定评价了酶解效率。HPMSM-trypsin酶解肽段产物的RPLC-ESI-MS/MS基峰色谱图如图7所示。图7中存在大量酶解肽段对应的分子离子峰,说明HPMSM-trypsin可以对复杂蛋白质样品进行有效的酶解。液相色谱-质谱联用分析所得的质谱原始数据经过MASCOT软件进行谱库搜索分析后所得结果表明:经HPMSM-trypsin酶解3 min后的样品可以鉴定到 2548 个肽段,归属于666个蛋白质。而在相同的液相色谱-质谱联用分析条件下,采用传统12 h溶液酶解样品可鉴定到 2437 个肽段,归属于577个蛋白质,这进一步证明了HPMSM-trypsin的高效、快速酶解能力。如图8所示,通过对鉴定到的蛋白质相对分子质量以及等电点分布统计分析发现,鉴定到蛋白质的相对分子质量分布在 5000 Da和 140000 Da之间,等电点分布于4到12,说明HPMSM-trypsin对复杂样品全蛋白酶解时没有偏性,可以应用于体液、组织或细胞等复杂体系的全蛋白酶解。

图 7 HPMSM-trypsin酶解酵母菌全蛋白质所得肽段的基峰色谱图 Fig. 7 Base peak chromatogram of tryptic digests of yeast obtained by HPMSM-trypsin
图 8 HPMSM-trypsin酶解酵母菌全蛋白质所鉴定到蛋白质相对分子质量分布以及等电点分布图 Fig. 8 Relative molecular mass and pI distribution of yeast proteins digested by HPMSM-trypsin
3 结论

本研究使用ATRP法将亲水聚合物修饰于硅胶颗粒表面,制备出一种新型亲水聚合物修饰的硅胶颗粒固定化胰蛋白酶。亲水聚合物的修饰提供了大量活性位点,因此显著提高了胰蛋白酶的固载量。另一方面,亲水聚合物修饰提高了基体材料对蛋白质非特异性吸附的抵抗能力,从而明显减少了样品损失,有利于提高蛋白质定性研究的灵敏度和定量研究的准确度。该固定化酶可在1～3 min内对标准蛋白质或酵母菌全蛋白质实现高效酶解,所鉴定到的肽段序列覆盖率和鉴定蛋白质数量超过同样条件下溶液酶解12 h的结果。进一步分析表明,新型亲水聚合物-硅胶颗粒固定化酶的酶解效率具有良好的稳定性,对蛋白质底物无明显偏性,并可反复使用,因此在蛋白质组学研究中具有较好的应用前景。

参考文献
[1]Elias J E, Gygi S P. Nat Methods, 2007, 4(3): 207  
[2]Elias J E, Haas W, Faherty B K, et al. Nat Methods, 2005, 2(9): 667  
[3]Ahrens C H, Brunner E, Qeli E, et al. Nat Rev Mol Cell Biol, 2010, 11(11): 789  
[4]Kocher T, Superti-Furga G. Nat Methods, 2007, 4(10): 807  
[5]Ren D, Pipes G D, Liu D J, et al. Anal Biochem, 2009, 392(1): 12  
[6]Lin S, Yao G P, Qi D W, et al. Anal Chem, 2008, 80(10): 3655  
[7]Qian K, Wan J J, Qiao L, et al. Anal Chem, 2009, 81(14): 5749  
[8]Li Y, Xu X Q, Deng C H, et al. J Proteome Res, 2007, 6(9): 3849  
[9]Liang Y, Tao D Y, Ma J F, et al. J Chromatogr A, 2011, 1218(20): 2898  
[10]Ma J F, Liang Z, Qiao X Q, et al. Anal Chem, 2008, 80(8): 2949  
[11]Ma J F, Liu J X, Sun L L. Anal Chem, 2009, 81(15): 6534  
[12]Calleri E, Temporini C, Gasparrini F, et al. J Chromatogr A, 2011, 1218(49): 8937  
[13]Jiang H, Yuan H M, Liang Y, et al. J Chromatogr A, 2012, 1246: 111  
[14]Lutz J F. Adv Mater, 2011, 23(19): 2237  
[15]Pokorski J K, Breitenkamp K, Liepold L O, et al. J Am Chem Soc, 2011, 133(24): 9242  
[16]Raynor J E, Petrie T A, Garcia A J, et al. Adv Mater, 2007, 19(13): 1724  
[17]Song Z F, Zhang Q L, Zhang Y J, et al. Chinese Journal of Chromatography (宋子凤, 张庆林, 张养军, 等. 色谱), 2012, 30(6): 549
[18]Krogh T N, Berg T, Hojrup P. Anal Biochem, 1999, 274(2): 153